plasmid und klonierung

Restriktion Enzyme sind Enzyme, welche DNA Moleküle an bestimmten Stellen schneiden oder spalten können. Sie erkennen spezifische DNA Sequenzen und schneiden die DNA an diesen Stellen.

EcoRi Enzym

DNA enden, welche nach der Spaltung überlappende Basenpaare besitzen

Diese Basenpaare können dazu benutzt werden, zwei DNA Fragmente Komplementär miteinander zu verbinden

EcoRv Enzym

DNA enden, welche nach der Spaltung keine überlappen Basenpaare besitzen

Diese können nicht so leicht miteinander verknüpft werden, wie die Sticky ends

Rekombinantes Plasmid

Hitze, Elektroporation oder andere Methoden

Zu amplifizierendes Gen

Transgene Zelle

1. Sie enthalten Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme.

   (diese Erkennungssequenzen erlauben es, Restriktionsenzym am Plasmid zu binden und an diesem zu schneiden)

2. Viele Plasmide weisen Gene für Resistenz gegen Antibiotika auf

3. Die beiden Gene für Resistenz gegen Antibiotika werden genutzt, um zu überprüfen, ob der Gentransfer erfolgreich war

1. Nur wenige Wirtszellen nehmen den Vektor tatsächlich auf

2. auch das verknüpfen des Fremdengens mit der Plasmid DNA erfolgt nicht immer fehlerfrei, so dass nicht alle Vektoren, die Fremd DNA enthalten

1. Ampicillin (Ap)

2. Tetracyclin (Tc)

Plasma lassen sich künstlich so modifizieren, dass sie eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym aufweisen, die innerhalb eines der beiden Antibiotikaresistenzgene liegt

Sollte das Plasmid das fremdgehen aufgenommen haben zum Beispiel innerhalb des Ampicillin gens würde die Resistenz gegenüber des Arzneistoff Ampicillin verloren gehen.

Das gen für Tetracyclin Resistenz wäre weiterhin intakt

Diejenigen, die auf einem Nähr Medium mit Tetracyclin wachsen, weil sie aufgrund des funktionsfähigen Tetracyclin Resistenz Gens gegen diesen Feind Resistenz sind aber auf einem Nähr Medium mit Ampicillin kein Wachstum zeigen haben das fremdgehen in sich integriert,

Die inAktivierung des Ampicillingens kennzeichnet also dass ein Gentransfer stattgefunden hat.

Es hat breite Anwendungsgebiete in Biotechnologie und Bio medizinischer Forschung wie der Produktion von Proteinen, Arzneimittel und Impfstoffen, der Schaffung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften sowie der Identifizierung von DNA Spuren und der gezielten Gen Veränderung.

DNA-Ligase

Dieses Enzym klebt die Menschen DNA mit dem Plasmid an den Sticky ends zusammen

1. DNA Isolierung/Extraktion

2. Restriktion

3. Ligation

4. Transformation

Rekombinantes Plasmid wird nun in eine Wirts Zelle eingeführt, wo es repliziert und das eingefügte DNA Fragment exprimiert wird.

Hierbei muss die Zellwand der bakterien durchlässig gemacht werden, um das Plasmid aufzunehmen, zum Beispiel durch Elektroporation oder chemische Transformation

• einfache Handhabung: Wächst unter einfachen Bedingungen wie einem Nähr Medium und einer Temperatur von 37 °C

• Schnelle Vermehrung

• Kleine Größe

  Das macht es einfacher, es in großen Mengen zu kultivieren und zu manipulieren

• Bekannte Genom Sequenz

  Das Genom von Ekol ist vollständig sequenziert und bekannt

• Verbreitung in der Natur

  E. coli ist ein natürlich vorkommendes Bakterium im menschlichen Darm und in vielen anderen Umgebung

Das Methylierungssystem ist ein von bakterien genutztes System zum Schutz ihrer eigenen DNA vor Restriktionens Enzym. Durch die Methylierung können Bakterien zwischen Eigner und fremder DNA unterscheiden. Methyltransferasen fügen Methylgruppen an spezifische Basen wie Adenin oder Cytosin der DNA Sequenz an. Restriktions Enzyme, die in das Bakterium eindringen, können die markierte Bakterien DNA nicht schneiden da die Methylierung die Bindunsstellen der Enzyme blockiert.

Blau – Weiß – Selektion

Ampicilin Antibiotikaresistenzgen und ß-Galaktosidase-Gen

Auf einen Nährboden mit Ampicilin & X-Gal (zucker)

1. die Bakterien, die kein Plasmid aufgenommen haben, sterben, weil ihnen das Gen gegen Antibiotikaresistenz fehlt

2. Die Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben, allerdings ohne fremdgen färben sich blau ein, weil sie immernoch das ß-Galaktosidase-Gen In sich tragen und dieses ermöglicht ein Enzym zu synthetisieren welches den Zucker X-Gal verarbeiten kann. Die Produkte dieses Prozesses sind blau.

3. Die Bakterien, die ein Blasmid mit fremdgehen aufgenommen haben, überleben zum einen auf dem Meer Boden und zum anderen. Färben Sie sich nicht blau ein und bleiben weiß, weil sie kein Gen in sich tragen was ermöglicht den Zucker zu verarbeiten und somit kein blaues Produkt dieses Prozesses entstehen kann.