VL 2: pharmazeutische Proteine II

• Bei zytoplasmatischer Expression kann das Protein intrazellulär als unlöslicher Einschlusskörper (inclusion body) oder als lösliches Protein vorliegen

Einschlusskörper entstehen in Bakterien durch Akkumulation von falsch gefalteten und aggregierten Proteinen, da durch Verwendung starker Promotoren extrem viel Protein synthetisiert wird

Proteine müssen denaturiert und neu gefaltet werden

Vorteile sind aber, dass

• Proteine zwar noch korrekt gefaltet werden müssen, aber im Einschlusskörper vor proteolytischem Verdau geschützt sind

• auch toxische Proteine produziert werden können

1. es muss zunächst eine Klonierung des Gens in passende Expressionsvektoren erfolgen

2. die Expression wird oft über IPTG reguliert

3. das Reinigungsverfahren muss an das Auftreten von inclusion bodies angepasst werden

4. es muss ein upstream processing und downstream processing erfolgen

5. es muss die Reinigung der Proteine über chromatographische Reinigungsverfahren erfolgen

Bioreaktor Betriebsphasen

• Upstream Processing (Befüllen, Sterilisieren, Mischen)

• Kultivieren (Züchtung und Produktion)

• Downstream Processing (Ernten und Aufarbeiten)

induzierbare Vektoren —> IPTG (Analogon der Allolactose einem Isomer von Lactose)

IPTG —> wird bei Aufnahme von Lactose in Zellen gebildet und reguliert oft Expression

Expressionsvektor benötigt:

• Antibiotikaresistenzgen: für Selektion transformierter Zellen

• LacI gen: für Synthese des Lac-Repressors, LacI

• LacO site: Site mit Lac-Operatorsequenz. Ohne IPTG bindet LacI hier und verhindert Genexpression

• T7 promoter: für Initialisierung der Transkription. Promotor liegt neben der LacO site. Wenn LacI an LacO site bindet, wird die Bindung der RNA-Polymerase an den Promoter inhibiert

• ORF: open reading frame, hier wird das gene of interest

  
  

  ohne IPTG:

  • Repressor aktiv

  • keine Transkription der T7-Polymerase

  • keine Expression des rekombinanten Proteins

  
  

  mit IPTG:

  • IPTG bindet an den Repressor und löst ihn vom Operon

  • • T7 wird exprimiert und kann am T7-Promotor des Expressionsvektors binden

  • • Gewünschtes Protein wird hergestellt

• Affinitätschromatographie

  • Trennung über sprezifische Bindung

• Ionenaustauschchromatographie

  • Trennung über Ladung

• Größenausschlussgromatographie

  • Trennung nach Größe

• Phasen/Umkehrphasenchromatographie

  • Trennung nach Polarität

• Statioäre Matrix präsentiert Bindungspartner oder Antikörper

• Nur spezifisches Protein wird gebunden, alles andere läuft durch

• Eluiert wird mit idealem Bindugnspartner oder hoher Salzkonzentration

• Bindung erfolgt spezifisch z.B.

  • Antikörper-Antigen

  • Rezeptor-Ligand

  • Enzym-Substrat

  • DNA-DNA bindendes Protein

  • Tag-bindungspartner (z.B. His-Tag & Nickel)

  
  

Kationenaustausch:

• Stationäre Matrix ist negativ geladen

• Positiv geladenen Proteine binden

• Negativ und neutral geladene Proteine laufen durch

• Elution mit Salzgradient (konz ansteigend)

• Proteine werden getrennt nach ihrer Ladungsstärke abgelöst

Anionenaustausch:

• Starionäre Phase ist positiv geladen

• Negativ geladene Proteine binden

• Positiv und neutrale Proteine laufen durch

• Elution mit Salzgradient

• Proteine werden getrennt nach ihrer Ladungsstärke abgelöst

Normalphasenchromatographie:

• Trennung nach Polarität

• Stationäre Phase ist hydrophil

• Mobile Phase ist hydrophob

• Hydrophobe Proteine eruieren zuerst

Umkehrphasenchromatographie:

• Trennung nach Polarität

• Stationäre Phase ist hydrophob, unpolar

• Mobile Phase ist hydrophil, polar

• Je hydrophiler (polarer), dest schneller eruiert ein Protein

• Trennung nach Größe

• Stationäre Matrix ist ein poröses Material

• Protein größer als Pore -> Protein läuft schneller durch

• Protein kleiner als Pore -> Protein dringt in Poren ein und läuft langsamer durch

• Proteine kommen nach Größe getrennt aus der Säule (Große zuerst)