Vorlesung 4 "Anwendung der Fluoreszenzspektroskopie"

• λ exc fest

• Aufzeichnen der Fluoreszenzintensität als Funktion der Emissionswellenlänge λ em

• λ em fest

• Aufzeichnen der Fluoreszenzintensität als Funktion der Anregungswellenlänge λ exc

• Durch Anregung von Elektronen

• Fragment Molekül kann durch Licht angeregt und Elektron wird angeregt

  1. Thermal dissipation (Strahlungslos abgeben) - keine Emission

  2. Fluoreszenz (Jablonski Diagramm)

  3. Energie Transfer an ein benachbartes Molekül

  4. Verlust der Energie durch Oxidation

• Durch Strahlung: Fluoreszenz oder Phosphoreszenz

• Strahlungslose Übergänge

  • Internal conversion

    Abgabe in Form von thermische Energie über Schwingungen und Übergang in Grundzustand über höhere Schwingungszustände

  • Quenching

    Abgabe der Energie an andere Moleküle (Quencher)

  • Photobleaching

    chemische Umwandlung des Fluorophores im angeregten Zustand, damit keine weitere Fluoreszenz

• In den erlaubten Triplettzustand

• unerlaubten Singulettzustand

Die Spinmultiplizität ist ein Begriff aus der Quantenmechanik und der Spektroskopie, der die Anzahl der möglichen Orientierungen eines Quantensystems mit einem bestimmten Spin beschreibt. Sie ist ein Maß dafür, wie viele verschiedene energetische Zustände ein System in einem Magnetfeld haben kann.

• Bei Anregung von Elektronen in Molekülen ist der Spin der Elektronen zu berücksichtigen!

• Dieser wird durch die Spinquantenzahl s ausgedrückt - mögliche Werte für s: + 1⁄2 oder - 1⁄2

• Bei zwei Elektronen ist der Gesamtspin S die Summe der Einzelspins – S = s1 + s2

• Sind die beiden Spins antiparallel resultiert: – S = (+1⁄2) + (-1⁄2) = 0

• Bei parallelen Spins gilt: – S = (+1⁄2) + (+1⁄2) = 1

• Beschrieben wird dies mit dem quantenmechanischen Begriff der Spinmultiplizität = 2∙S + 1

• Bei antiparallelen Spin ergibt sich eine Spinmultiplizität von {2∙0 + 1 = 1}. Man spricht von einem Singulettzustand (S).

• Bei parallelen Spin ergibt sich eine Spinmultiplizität von {2∙1 + 1 = 3}. Man spricht von einem Triplettzustand (T).

strahlungsloser Energieverlust durch photochemische Reaktion meist aus dem Triplet Zustand

• hohe Probenkonzentrationen (Selbstabsorption)

• kleinste Mengen von Fremdsubstanzen können die Fluoreszenz stören (Quenching)

In der Photochemie bezeichnet Quenching die Verringerung der Fluoreszenz oder Phosphoreszenz eines Moleküls. Dies kann durch verschiedene Mechanismen geschehen, wie zum Beispiel durch die Anwesenheit von Quenchern (Substanzen, die den angeregten Zustand eines fluoreszierenden Moleküls deaktivieren) oder durch Strahlungslosen Übergang (non-radiative deactivation).

• Collisional /Dynamic Quenching

  • Quencher kollidiert mit angeregtem Fluorophore, dadurch verliert Fluorophore Energie

• Static quenching

  • Stabiler Komplex von Quencher und angeregtem Fluorophore (“Dark complex”)

• Färbung der Gele mit 2 Fluorchromen

• Anregung auf verschiedenen wellenlängen

1. Datenerfassung des Gels

2. Vorverarbeitung (Filtern etc.) und Segmentierung

3. Transformation in andere Darstellungsform

4. Klassifizierung und Analysieren

5. Verfeinern

6. Interpretation

• FRET Förster Resonance Energy Transfer

• FLIM Fluorescence Lifetime Imaging

• FRAP Fluorescence Recovery After Photobleaching

• Ganze Probe wird betrachtet

• Alle Signale werden detektiert

  • Führt zu niedrigem Kontrast in dicken Proben

• Am besten geeignet für dinge Spezien mit wenig Autofluoreszenz

  • z.B adjärente Zellen

• Scannen der Probe in einem RasterMuster, werden Bilder einer einzigen optischen Ebene erzeugt.

• 3D-Objekte können visualisiert werden durchScannen mehrerer optischer Ebenen und Stapeln der Bilder mit einer geeignetenMikroskopie-Entfaltungssoftware gestapelt werden (z-Stack).

• Es ist auch möglich, Multicolor Immunfluoreszenzfärbungen mit modernen konfokalen Mikroskopen die mit mehreren Lasern und Emissions-/Anregungsfiltern ausgestattet sind.

• Fokussiert das einfallende Licht

Förster Resonance Energy Transfer

• Nichtstrahlende Energieübertragung zwischen Fluorophoren

• Voraussetzung:

  1. Spektren müssen sich überlappen

  2. Günstige räumliche Orientierung

  3. Passender Abstand

• Messung erfolgt

  1. direkt über Fluoreszenzitensität des Donors und Akzeptors = weniger Donor und mehr Akzeptor bedeutet FRET

  2. Lebensdauermessung des Donors

• Effizienz proportional zu 1 / R6 und nimmt damit mit Abstand von A zu B sehr stark ab.

Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

• Anzeige der Fluoreszenzlebensdauer (angeregter Zustand eines Moleküls bis es in den Grunszustand zurückemittiert)

• z.B die Fluoreszenzlebensdauer von GFP eine Funktion seines lokalen Brechungsindex.

  • Ein niedriger Brechungsindex um GFP führt zu einer längeren Lebensdauer,während eine Umgebung mit hohem Brechungsindex zu einer kürzere Lebensdauer führt

• Die Fluoreszenzlebensdauer von anderen Sonden kann empfindlich sein auf pH-Wert, Ionen, Sauerstoff usw. reagieren.

• Messung mittels:

  1. FLIM Mikroskopie

  2. Konfokales oder zwei-photonen-mikroskop

• FRET tritt auf, wenn ein geeigneter Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe sind,in der Regel unter 10 nm.

• Mit der FRET-Bildgebung kann also gemessen werden

  die Nähe von fluoreszierenden oder oder mit Fluorophoren markierten Proteinen in lebenden Zellen mit dem 10-100fachen der Auflösungsgrenze in optischen FernfeldmikroskopenMikroskopen.

• Mit FLIM kann FRET zwischen einem Donor und Akzeptor durch eine verkürzte verkürzten Fluoreszenz Abklingens des Donors erkennen.

  
  

• Polarisationsaufgelöstes FLIM zur Durchführung zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie Bildgebung zeigt die Rotationsbeweglichkeit eines Fluorophors.

• Diese wird durch die Viskosität der Umgebung Umgebung oder durch Bindungs- und Konformationsänderungen, die sich auf die Rotationsbeweglichkeit beeinflussen.

• Letztere wird durch die Rotationskorrelationszeit, die sich

  die sich aus der Differenz zwischen der polarisationsaufgelösten Fluoreszenz

• I und I⊥ berechnen lässt. Eine schnelle Rotationsbewegung

  führt zu einer schnellen Depolarisation.

• Bei FRAP wird ein bestimmter Bereich einer Zelle oder eines Gewebes durch intensives Laserlicht photobleich gemacht, wodurch dieFluoreszenz aus diesem Bereich entfernt.

• Dieser Bereich ist in der Regel eine Zellmembran oder ein Bereich, in dem Diffusion stattfindet, z. B. der Zellkern, da FRAP erfordert, dass sich fluoreszierende Moleküle frei bewegen können, um zu funktionieren.

• Die Felder (a)-(d) zeigen ein FRAP-Experiment in einer Glycerinlösung. Die Felder (e)-(h) zeigen die entsprechenden Aktionen auf molekularer Ebene. Die blauen und roten Punkte sind gebleichte bzw. nicht gebleichte Moleküle.

• Der Unterschied zwischen der anfänglichen Fluoreszenzintensität und der Intensität zu sehr langen Zeit nach dem Bleichen ist ein Hinweis auf einen immobilen Anteil. IROI ist die durchschnittliche Fluoreszenz

  Intensität in der gebleichten Region.

• ein vielseitiges Instrument zur Bestimmung von Diffusions- und Interaktions-/Bindungseigenschaften in den biologischen und Materialwissenschaften.

• Diffusion: der Prozess, bei dem die Gesamtmasse einer Substanz durch Zufallsbewegungen verteilt wird.

  Diffusionskoeffizient - geschätzt aus der Halbwertszeit der Fluoreszenzerholung

• Einblicke aus FRAP

> Diffusion durch Cytosol oder Membran

> Transport durch Bläschen

> Bindung/Freisetzung

• Organische Moleküle

• Quantum dots

• Fluoreszente Proteine

• Fluorescin

  1. Konjugation mit Isothiocyanat an freie Aminogruppen im Protein

     • pH Abhängigkeit der Struktur von Fluorescein

• QDs sind die Materialklasse, in der Quanteneinschränkungseffekte nachgewiesen werden könnennachweisbar sind.

• Sie sind sehr kleine Halbleiterkristalle in der Größenordnung von Nanometern Größe, die nur einhundert bis tausend Atome enthalten.

• Daher können sie Elektronen oder Elektron-Loch-Paare, so genannte "Exzitonen", in allen drei Dimensionen ein.

• Die Emissionsspektren von QDs können durch Anpassung der Größe eingestellt werden.

  Die Helligkeit pro Partikel ist viel höher als bei kleinmolekularen Fluoreszenzfarbstoffen.

  Kein Photobleaching.

QDs enthalten eine halbleitende Kern-Hülle. Die Oberfläche muss mit biokompatiblen Materialien beschichtet werden

Materialien wie hydrophilen, hydrophoben und amphiphilen Liganden beschichtet werden, die mit

mit Proteinen, Medikamenten, Antikörpern und anderen Verbindungen verbunden werden können.

• Höchst 33342

  • bindet bevorzugt an Adenin-Thymin-Regionen (A-T) der DNA. Dieser Farbstoff bindet sich an die kleine Furche in der DNA und besitzt vom Verhältnis Farbstoff :

    Basenpaar abhängige charakteristische Fluoreszenz-Emissionsspektren

• Phalloidin

  • Toxin, welches aus dem giftigen Pilz Amanita phalloides isoliert

    wurde. Es ist ein bicyclisches Peptid, dass

    specifisch an F-actin bindet. Wird an Fluoreszenzmoleküle konjuguiert

• Mitotracker

  • Mitotracker sind Fluoreszenzfarbstoffe, die selektiv

    an Mitochondrien binden. Die Farbstoffe

    akkumulieren in der mitochondrialen Matrix.

• Lysotracker

  • Lysotracker sind azidotrophe Farbstoffe, die saure

    zelluläre Kompartimente wie das Lysosom anfärben.