V3 Proteinmodifikation und quantitative Proteinbestimmung

➢ Abbau in Peptide und Aminosäuren

➢ Stabilisierung oder Destabilisierung

➢ Veränderung der Löslichkeit

➢ Markierung von bestimmten Gruppen (z.B. Isotope, Fluoreszenz)

➢ Immobilisierung

➢ Vernetzung (cross-linking)

• Protein wird getagged, um es anschleßend zu modifizieren

• Geschieht an Cystein oder Lysin

• Z.B bei Insulin

• Modifizierung am N-terminus und den Lysisresten

➢ ε-Aminogruppen von Lysinen werden bevorzugt zur chemischen

Modifikation von Proteinen verwendet

➢ ε-Aminogruppen von Lysinen kommen häufig vor und liegen

meist an der Oberfläche. Basischer als N-terminale

Aminogruppe.

➢ Acylierung mit Anhydriden oder mit aktiven Estern bei >pH 9

➢ Acylierung entfernt positive Ladung der Aminogruppe, damit

deutliche Änderung der Eigenschaften

1. Acylierung der ε-Aminogruppen von Lysin mit Imidoester bei pH 9

1. Reduktive Alkylierung durch Reaktion mit Aldehyd und anschließender Reduktion

1. Reaktion mit Isothiocyanat zur Einführung fluoreszenter Gruppen

Derivatisierung von Cysteinresten mit Ioacetat, Iodacetamid und Maleinimid

➢ Derivatisierung von funktionellen Gruppen in Nachbarschaft zum Reagenz

➢ Verwendung von Arylaziden und Benzophenonen

➢ Aktivierung durch UV Strahlung erzeugt reaktive Gruppe, die mit benachbarten Aminosäureresten reagieren.

➢ Wird verwendet zum Markieren von Proteinen, in der Nähe von

aktiven Zentren.

• Spektroskopisch bei 205 oder 280 nm (A280 Methode!)

• Durch Färbetests

  • Biuret Assay

  • Lowry Assay

  • BCA Assay

  • Bradford Assay

• Messung der Aminosäurenkonzentration nach Hydrolyse

  • Quantitative Aminosäureanalyse

• Kann verschiedene Proteinbestandteile nachweisen bei unterschieldichen Wellenlängen

• Bildung eines rotvioletten Farbkomplex aus

  Cu2+ mit zwei CO-NH Verbindungen in alkalisch

  wässrigen Milieu

• Kolorimetrischer Nachweis für Peptide und

  Proteine

• Absorptionsmessung bei 550 nm.

• Tyrosinreste tragen zur Komplexbildung bei

• Störende Substanzen:

  • Ammoniumsulfat, Glucose, Sulfidhydylverbindungen, Natriumphosphat

• Weiterführng des Biuret Assay

• Kombination der Biuret-reaktion mit Folin-Ciocalteu-Phenol

  Reagenz. (Phospho-molybdat und Phospho-wolframat)

• Cu2+ wird im Biuret-Komplex zu Cu+ reduziert.

• Tiefblaue Färbung des entstehenden Farbkomplexes

• Kolorimetrischer Nachweis für Peptide und Proteine

• Absorptionsmessung bei 750, 650 oder 540 nm.

• Anfällig für EDTA, Ammoniumsulfat und Triton-X100

• Bindung eines Säurefarbstoffes an das Protein unter Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 zu 595 nm.

• Schnelle, einfache Reaktion

• Farbumschlag von Braun zu Blau

• Oft stark proteinabhängiger Absorptionskoeffizient

• Über die Kalibrigationsgerade die Menge zuordnen

• Störsubstanzen:

  • Triton

  • SDS

  • Natriumdesoxycholat

• Quantitative Messung der Proteinkonzentration durch Bestimmung der durch saure Hydrolyse freigesetzten Aminosäuren

• Quantitative Aminosäureanalyse durch HPLC (Vergleich zu

  Aminosäurestandards)

• Ergibt Konzentration der Aminosäuren sowie die Aminosäurezusammensetzung des Proteins

• Vergleich der theoretischen Aminosäurezusammensetzung (bei bekannter Proteinsequenz) mit den gemessenen Konzentrationen der Aminosäuren ergibt die Menge des Proteins

1. saure Hydrolyse des Peptids/ Proteins

2. Trennung, Detektion undQuantifizierung der Aminosäuren

• Saure Hydrolyse in 6M HCl (z.B. 24h bei 110°C)

• Unter Ausschluß von O2 zur Verhinderung von Oxidationen

• Zusatz von Scavengern (z.B. Phenol (1%), Mercaptoethanol ( 0,1%)) zum Entfernen von O2 –Resten

• Kürzere Hydrolysezeiteun durch Gasphasenhydrolyse

  • Derivatisierung zur Erhöhung der Empfindlichkeit (z.B. Ninhydrin, PITC)

  • HPLC Trennung und Detektion

• Hydrolyse von labilen Aminosäuren oder unvollständige Hydrolyse

• Bestimmung von Gesamt D aus (N + D) und Gesamt E aus (Q + E)

• Oxidation

Gebildetes Isoindol-derivat enthält den Aminosäurerest

Verwendung zur Vorsäulen- und Nachsäulenderivatisierung

• Reaktion von Phenylisothiocyanat (PITC)

  mit primären und sekundären Aminen

  unter Bildung eines Phenylthiocarbamoyl-Derivats (PTC)

• Absorptionsmaximum bei 245 nm

• Nachweisgrenze etwa 1 pmol