V4 Proteincharakterisierung udn Proteinsequenzierung

Mittels Top-Down und Bottom-up Analyse

• Top-down: intakte Proteine werden untersucht

• Bottom up: zerlegen in kleine Teile, Peptide analysiert

• Durch Hydrolyse an den Peptidbindugen

• z.B. Bromcyan, was sehr genau spaltet

• Saure Hydrolyse (partiell oder komplett)

• Chemische Spaltung, z.B. mit Bromcyan

• Enzymatisch mit Endo- und Exoproteases

1. Spaltung in Lösung

2. Spaltung auf membran

3. Spaltung im Gel

a. Denaturierung

b. Reduktion von Disulfidbrücken

c. Alkylierung von freien –SH Gruppen

d. Proteolyse

• sehr aggressiv

• oxidiert Schwefel

• eher selten

• DTT spaltet

• im leicht alkalyischen Milieu

• greift elektrophiles Zentrum an

• Hoch spezifische Reaktion des Bromcyans mit Methionin

• Führt zur Spaltung von Met-Xaa Bindungen

• Schlechte Ausbeuten für Met-Thr und Met-Ser Bindungen

• Reaktion in 70% Ameisensäure

  (Achtung: Hydrolyse von Asp-Pro Bindungen und Formylierung bei längeren Reaktionszeiten)

  • spaltet Methionin an C terminaler Seite

  • Schwefel reagiert mit Cyan

  • Stickstoff macht Ringschluss

• Exopeptidasen

  • Aminopeptidase

  • Carboxypeptidase

• Endopeptidasen

• Aktives Zentrum in Serin-, Cystein-, Aspartat- und Metalloproteasen

!Proteolyse abhängig von benachbarten Aminosäuren und der Proteinstruktur – oft unvollständig!

• Chymotrypsin

• Elastase

• Trypsin

• Endoproteinase ArgC

• Endoproteinase AspN

• Endoproteinase GluC

• Papain

• Pepsin

  
  

• Carboxypeptidasen

• Carboxypeptidase A

• Carboxypeptidase B

• Carboxypeptidase Y

1. Schrittweiser Abbau

2. Ladder Sequencing

3. Edman-Abbau

1. Kupplungsreaktion

1. Zyklisierung

2. Spaltungsreaktion

1. Konvertierung der ATZ AS

Länge der bestimmten Sequenz nimmt mit fallender Reaktionsausbeute ab

• Auswaschen des Proteins muss vermieden werden

• Ausbeute und Signalintensität abhängig von Aminosäure

• Heterogenität des N-terminus

• Blockierter N-Terminus (z.B. methyliert, acetyliert) nicht zugänglich für Edmansequenzierung

• Kontaminationen in Lösungsmittel erscheinen im HPLC Chromatogram als Störung

• Quantifizierung schwierig

• Einige Aminosäure werden unter Reaktionsbedingungen abgebaut (z.B. bis zu 80% des Serins, bis zu 50% des Tyrosins, Cystein underivatisiert nicht detektierbar)

• Verlust von posttranslationalen Modifikationen durch Hydrolyse

• Zunehmender Untergrund mit Zahl der durchgeführten Reaktionszyklen

• HPLC Trennung dauert ca. 20 min für einen Zyklus

• Aktivierung des C-Terminus

• Problem: andere Seitenketten reagieren, partielle saure

  Hydrolyse

• Kupplung mit Thiocyanat Reagens unter Bildung eines

  Peptidylthiohydantoins

• Abspaltung der C-terminalen Aminosäure ( verdünnte KOH)

• Leichte Auswaschung des Polypeptids

• Identifizierung des Aminosäurethiohydantoins mit HPLC

• Problem: sehr hydrophil, damit schlechte Trennung

• Peptide mass fingerprinting

• Fragment-ion search

• De-novo Sequenzierung

  • Sequenzbestimmung durch Interpretation von Massenspektren unter Verwendung der Massen von Fragmentionen (ohne Datenbanksuche)

• Vergleich der gemessenen Peptidmassen mit berechneten Massen der proteolytischen Peptide aus Proteinsequenz in Datenbank ermöglicht dentifizierung des Proteins

• Erfordert reine Proteine

• Mischung von Proteinen nicht zugänglich für PMF

• Kenntnis der Spezies oft notwendig

• Geeignet zur Identifizierung aus 2D Gelen und von gereinigten Proteinen