V6 Antiktöper und Immundetektion

• Cross-reactivity

• Variability

• Wrong-Apllication

• DTT

• Paparin

• Pepsin

1. Alylation und Adification

2. Reduktion mit DTT oder Mercaptoethanol

3. Papain (spaltet die Disulfidbrücken der Hinge Region)

4. Pepsin (spaltet Fc Teil)

• Polyklonal

  • erkennt alle Oberflächen

  • verschiedene AK die das gleiceh AG binden

• Monoklonal

  • AS identisch

  • entstehen aus einem Zellklon

1. Maus wird immunisiert

2. Milzzellen werden geerntet

3. Milzzellen werden mit Myelomazellen fusioniert

4. Wachstum auf Selektivnährboden

5. Ernten

• Western Blot

• ELISA

• FACS

• Immunohistochemie

• Phagen-Display

• Affinitäts-anreicherung / - chromatographie

• Immunpräzipitation

1. Sequentielle oder kontinuierliche Epitope

   • Elisa, WB

   • sind hintereinanderliegende Epitope

2. Diskontinuierliche Epitope

   • ELISA

   • verschiedene Bereiche der AS, kein Western Blot

3. verborgene Epitope

   • WB

   • im inneren der Struktur

4. durch Proteolyse entstandene Epitope

   • ELISA

   • durch Enzymspaltung,, bilden neuen Terminhs

1. Andere Art Tier

2. Bestimmte Größe und Träger

3. Diversität und Kapazität

4. Strukturelle Eigenschaften, ladung

5. Zuhänglichkeiz

6. Denaturierung und Aggregation können immunogene Potenz erhöhen

7. Epitope besitzen hohen Antigendindex

• Testen der Ab-Bindung von synthetischen Peptiden die systematisch die Proteinsequenz abdecken

• Das kleinste Peptide mit hoher Bindungsstärke

  entspricht dem Epitop im Antigen

• Saure Bedingungen

• Alkalische Bedingungen

• Chaotrope Ionen

• Epitope

• Erhöhte Temperaturen

1. Immunpräzipation (“Ausfällen”)

2. Indirekte Immunpräzipation (Co-immunoprecipation)

• Menge des präzipierten Antikörpers abhängig vom

  Verhältnis Antigen zu Antikörper

• Unterschiedliche Verhältnisse Antigen zu Antikörper

  und Einfluss auf Löslichkeit

1. Präzipierende System

2. Nicht-präzipierende System

3. Kombiniertes Präzipierendes System

Präzipierendes System aus einem Antigen mit drei antigenen

Determinanten (Epitop 1-3) und den drei passenden Antikörpern

Nicht-präzipierendes System aus einem Antigen und einem Antikörper

• Präzipierendes System aus einem Antigen mit drei identischen Epitopen

  und monoklonalen Antikörper identischer Spezifität

• Besteht aus Digomeren

• Ringtest

• Eindimensionale Immundiffusion nach Oudin unter Verwendung eines weitmaschigen 1% Agarose gel

• Eindimensionale Doppeldiffusion nach Oakley/ Fulthorpe

• indirekten Immunpräzipitation

• Chromatin Immunpräzipitation ChIP

Protein A wird auf der Oberfläche von Gelkügelchen immobilisiert. Protein A bindet an die Fc-Region der Immunglobuline. Das Antigen bindet an das immobilisierte IGG.

• Bindungstests zwischen Antigen und Antikörper dienen als Grundlage fürverschiedene Assay-Formate

  Nach Immobilisierung eines der beiden Bindungspartner erfolgt

Unterscheidung zwischen spezifischen und nicht-spezifischen

Bindungen.

• Surface-Plasmon Resonance (SPR, Biacore) mit Markierung

• Fluoreszenz (z.B. Markierung mit Fluorescein-Isothiocyanat (Albert Coons,1941)

• Radioaktivität

• Reduktionsvorgänge

• Kolloidales Gold

• Enzymatische Reaktionen durch gebundenes Enzym

a. direkte Methode

b.indirekte Methode

c.unmarkierte Methode

d.doppelt unmarkierte Methode

e. Biotin-Avidin Brücke

f. Amplifikator-markiertes Protein

g.direkte Protein A Gold Methode

h. indirekte Proteine A Gold Methode

• bei der Immobilisierung

• Affinitätschromatographie

• Western Blot

• ELISA

• DNA/RNA Hybridisierung

Übertragung von Proteinen auf Membran mit anschließender Bindung einesAntikörpers an membran-gebundenes Protein. Detektion der Antikörperbindung über Enzymreaktion oder Chemilumineszenz.

1. Trennung der Proteine mit SDS PAGE

2. Transfer auf Membranen

3. Blockierung freier Membranoberflächen

4. Bindung eines protein-spezifischen Antikörpers

5. Detektion des Protein-Antikörper Komplexes

• Passiver Membrantransfer durch Kapillarblotting

• 2x Aktiver Membrantransfer durch Elektroblotting

1. Mit Transferpuffer getränktes Filterpapier

2. Gel mit getrennten Proteinen

3. Membran, meist Nitrocellulose

4. Filterpapier

Semi-dry Blotting

Gel und Membran werden zwischen Filterpapiere gelegt. Transfer bei konstantem Strom, z.B.

1 mA pro cm2 Blotfläche.

Transferpuffer meist Tris-Glycin pH 8,3 mit 20 % Methanol

Tank Blotting

Gel und Membran werden zwischen Filterpapiere gelegt. Konstante Spannung um 50 mV.

Tris-Glycin pH 8,3 mit 20 % Methanol oder auch CAPS Puffer pH10.

Blockierung der freien Membranoberfläche verhindert

nicht-spezifische Bindung des Antikörpers

Blockingreagenz kann Proteinsignal abschwächen

1. direkt durch an Primär-antikörper-gebundenes Enzym

2. indirekt durch Verwendung seines Sekundärantikröper

Konzentration des Sekundärantikörpers

• Meerrettich Peroxidase (HRP)

  • Hohe spezifische Aktivität, oft erste Wahl

• Alkaline Phosphatase (AP)

• Chromogen (Farbreaktion) (5-500 pg)

• Chemolumineszenz (1 -10pg)

• Fluoreszenz (2-20 pg)

Luminolemission nimmt mit der Zeit ab

• es gibt zu wenig und zu viel pH

• Am intensivsten mit 8,4

• Optimum bei 1,2 mM

• Kompetition des „kalten“ (nicht-radioaktiven) Antigen

  mit dem markierten radioaktiven Antigen.

• Messung der Radioaktivität in Abhängigkeit der Menge des

  kalten Antigens.

Nephelometrie/turbidimetrie

• Verhältnis von AG/AK

• Messung nach Streuung

• Indirekt

• Direkt

• Sandwich

• Kompetitiv

• Über Avidin-Biotin Komplex

• Über Protein A/G Bindung zu FcR Bindungsstelle

• Kovalent

• Elektrodenreaktionen regen Ruthenium-Komplexe (Ru2+-bipyridyl) zurEmission von Photonen an.

• Oxidation an der Elektrode folgt Reduktion mit zweitem Reagenz zu einem angeregten Ru2+* Zustand, der über Lichtemission in Ru2+ übergeht

• werden angeregt , geben Licht ab