Aus welchen Nukleinbasen besteht die DNA und RNA?
Adenin
Guanin
Cytosin
Thymin
Uracil
Wie sehen die 4 wichtigsten Ribonucleoside aus?
Was sind die vier wichtigsten Deoxy-Ribonucleoside?
Wie sieht die Primärstruktur der DNA aus?
Bei welchem pH-Wert protoniert Adeonsin?
Welche Keto-Enol Tautomere gibt es?
Wie sieht die Basenpaarung nach Watson Crick aus?
Welche Konformationen hat Ribose?
Wie sehen die Primärstrukur der DNA in A-Form, B-Form und Z-Form aus?
Wie sehen Absoprtionskurve der DNA aus?
Wie sehen die Schmelzkurven der DnA aus?
Wie sieht der Renaturierungsprozess der DNA von Oligonucleotiden aus?
A:
zipping
Loop formation
B
nucleation
Loop Formation
Zipping up
Was ist wichtig bei der Entwicklung von Methoden zur Synthese von Oligonucleotiden?
➢ Schutzgrupen für Nukleinbasen (Aminogruppe)
➢ Schutzgruppen für 5‘ und 3‘-OH Gruppe
➢ Effektive Kopplungsreaktion
Wie sieht ein modifiziertes Nukleotid aus?
Was sind übliche Schutzgruppen für Nucleinbasen?
deoxyribonucleosid adenosin (dA)
deoxyguanosin (dG)
deoxycytidin (dC)
Wie läuft die Festphasensynthese einer DNA Kette mit der
Phosphit-triester-methode ab?
1. Schutz der Nukleosid-Hydroxylgruppen.
2. Aktivierung des Nukleosids durch Phosphorylierung.
3. Kupplung der aktivierten Nukleoside zur Verlängerung der Kette und Oxidation
4. Entfernen der Schutzgruppen.
5. Wiederholen der Schritte 1–4 für die gewünschte Sequenz.
6. Endgültige Entschützung und Reinigung des Oligonukleotids.
Was ist wichtig bei der Phosphit-triester-Methode?
➢ Effektive Kopplungsreaktion mit Ausbeute >98%
➢ Nebenreaktionen reversibel
➢ Synthese von bis zu 150mer Oligonucleotiden
➢ Ermöglicht Synthese von kurzen Oligonucleotiden in Mengen einiger Gramm
Warum macht man eine DNA/RNA Analyse?
Warum DNA/RNA Analyse?
▪ Sequenzierung de-novo
▪ Kartierung von Genen
▪ Genotyping
▪ DNA/RNA Protein Interaktionen
▪ Mechanismus und Kontrolle Transkription/
Translation
▪ Epigenetics
▪ Rolle von Junk DNA?
Was für Arten von DNA Mutationen gibt es?
WT
Substitution (A>G. c>G)
Deletion (single)
Deletion (segment?
Welche Reinigungs- und Trennmethoden gibt es?
▪ Phenolextraktion
▪ Ethanolpräzipitation
▪ Gelfiltration
▪ Konzentrationsbestimmung
Wie läuft die Phenolextraktion ab?
Phenolextraktion wässriger DNA Lösungen zur
Entfernung von Proteinverunreinigungen
Organische Phase: Phenol/Tris:HCl pH7,5 oder
Phenol mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1)
Wie läuft die Gelfiltration zur Reinigung von Nukleinsäuren ab?
Trennung von größeren DNA-Molekülen von kleineren Verbindungen (Gelfiltration = Size-Exclusion)
Wie läuft die Ethanolpräzipation von Nukleinsöuren ab?
A: Wässrige Nucleinsäurelösung nach phenolischer Extraktion wird mit 2,5 bis 3 facher
Menge absoluten Ethanols versetzt und Nucleinsäuren präzipitiert.
B: Hochmolekulare DNA kann durch vorsichtiges Überschichten mit Ethanol an der Phasengrenze ausgefällt werden.
Wie läuft die Reinigung der DNA über Dichtegradienten ab?
CsCl Dichtegradienten-Zentrifugation zur Isolierung von Plasmid-DNA. Aufgrund unterschiedlicher Dichte werden superhelikale Plasmide von nicht-superhelikalen getrennt.
Welche Verfahren gibt es zur Aufarbeitung und Trennmethoden?
▪ Anionenaustausch-Chromatographie
▪ Isolierung von polyA-RNA durch poly-T Beads
▪ Gelelektrophorese
Wie läuft die Reinigung der DNA über Anionenaustauschsäulen ab?
Negativ geladene DNA bindet bei einer Salzkonzentration von 0,75 M.
Auswaschen von degradierter DNA und von Proteinen bei 1 M.
Elution mit > 1,25 M Salzlösung.
Welche Arten von Austauschersäulen gibt es?
Midi spin column
Maxi spin column
8-well strips
Mini spin columns
Wie läuft die Isolierung von polyA-RNA über Oligo-dT Säule?
Was sind Kriterien bei der Gelelektrophorese von Nukleinsöuren?
➢ Trennprinzip – Abhängigkeit von Größe und Form
➢ Agarose- und Polyacrylamidgele
Wie sieht das Globuläre Modell aus?
Wanderung der Moleküle in Abhängigkeit von Verhältnis
Porengröße (Gel) zu Partikelradius
Wie sieht das Reptationsmodell aus?
Ausrichtung der Moleküle im elektrischen Feld und „schlangenartige“ Bewegung durch Gelmatrix.
Wie sieht das Wanderverhalten der DNA aus?
Was sind die Vor- und Nachteile von Agarose- und Polyacrylamidgelen?
Wofür werden Native Gele verwendet?
zur Bestimmung von „Single strand conformational polymorphism“ (SSCP)
Was ist bei Trennung in denaturierenden Polyacrylamidgelen zu beachten?
➢ Denaturierungsmittel Harnstoff oder Formaldehyd
➢ Polymerisation der Gele mit 7 M Harnstoff
➢ Auftragspuffer mit Formamid zur Denaturierung
➢ Trennung von DNA Molekülen, die sich um 1 Nucleotid in der Länge unterscheiden
➢ Anwendungen zur Sequenzierung und zur Analyse von Restriktionsfragmenten
➢ Anwendbar als kapillarelektrophoretische Methode
Was sind Vorteile der DNA Kapillargelelektrophorese (CGE)?
hohe Auflösung, Automatisierung, hohe Empfindlichkeit
Verwendung von vernetzen Polyacrylamidgelen oder „Fließ“-Gelen aus lineares
Polyacrylamid oder Hydroxymethyl-cellulose,etc.
Was sind Vorteile der Pulsfeld - Gelelektrophorese (PFGE)?
➢ Auftrennung von hochmolekularen Nucleinsäuren durch konventionelle Gelelektrophorese nicht möglich („limiting mobility“)
➢ Dies ist durch Anlegen von Wechselfelder in der PFGE möglich
➢ Orientierung im Wechselfeld ist stark abhängig von Größe aufgrund der Zeit die zur Ausrichtung des Moleküls im Feld benötigt wird.
Wie ist das Prinzip der Prinzip der Feldinversionsgelelektrophorese (FIGE)?
Es werden abwechselnd zwei um 180° verschiedene elektrische Felder angelegt.
Die Wanderrichtung zur Anode kann durch einen längeren oder stärkeren Puls in dieser Richtung festgelegt werden.
Weitere PFGE Methoden mit komplexer Anordnung der Elektroden
Was sind Färbemthoden für Gele?
➢ Fluoreszenzfarbstoffe wie Ethidiumbromid
➢ Silberfärbung
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