Was ist die klassische Vorgehensweise bei der DNA Sequenzierung?
Isolierung und Reinigung der Nucleinsäure
Klonierung oder PCR Amplifikation
DNA Aufreinigung für die Sequenzierungsreaktion
DNA Sequenzierung und Elektrophorese
Rekonstitution der ursprünglichen Sequenz-information
Fehlerkorrektur und Sequenzdatenanalyse
Sanger
Wie funktioniert die DNA Sequenzierung mittels
Kettenabbruchmethode nach Sanger?
Erzeugung einer Mischung von Oligonucleotiden mit 3`dideoxy-Nucleotid
Analyse der Mischung aus Abbruchprodukten mittels Gelelektrophorese
Wie funktioniert die Einführung fluoreszierender Markierungen in DNA Sequenzierungsreaktionen?
Fluoreszenzfarbstoff verändert elektrophoretische Mobilität und führt zur
Verschiebung der Banden: Ausgleich durch Software.
Was sind Vor- und Nachteile fluoreszierender Markierungen in DNA Sequenzierungsreaktionen?
Vorteile:
Verunreinigungen (elf-priming) nicht sichtbar
unmarkierte Primer verwendet
unmarkierte Abbruchprdukte sichtbar
Nachteile:
Höhrere Primerkosten
Vermeidung von Mehrfachinkoperation
Von Polymerasen schlechter eingebaut
Wie funktioniert der Fluoreszenznachweis von Oligonucleotidfragmenten?
Sequenzierreaktion wird mit vier Didesoxynucleotiden durchgeführt, von denen jedes eine Fluoreszenz-Markierung trägt, die bei einer anderen Wellenlänge fluoresziert
Wie funktioniert das Parallel-Kapillargerät?
Strangsynthese und Pyrophosphorolyse
Freisetzung von Pyrophosphat und Proton bei Kopplungsreaktion
Zugabe von Pyrophosphatase zur Vermeidung der Rückreaktion
Wie kann man sequenzieren?
schrittweiswr Abbau
Ladder Sequencing
Wie funktioniert die Strangsynthese durch Nucleotid-analoga?
Struktur von Desoxynucleotidanaloga in Dideoxysequenzierungsreaktionen
Verwendung zur Vermeidung stark GC-haltiger Abschnitte durch Verhinderung der Bildung von Wasserstoffbrücken
Maxam-Gilbert
Wie funktioniert das Ladder Sequencing?
Erzeugung einer Serie von Teil- Oligonucleotiden
Durch Synthese:Sanger
Durch Spaltung: Maxam-Gilbert
Wie funktioniert die chemische Spaltung nach Maxam und Gilbert?
Wie läuft die G Spaltungsreaktion ab?
was sind die Vier Basenspezifische Abbaureaktionen zur DNA
Sequenzierung? nach welchen Basen wird abgebaut?
Pyroseauenzierung
Wie läuft die Sequenzierung der Strangsynthese ab?
Detektion des Pyrophosphats: Pyrosequenzierung
Gekoppelte enzymatische Reaktion zur Detektion
des freigesetzten Pyrophosphats
ATP Herstellung aus Adenosinphosphosulfat und Pyrophosphat
ATP treibt Luciferasereaktion an und bewirkt Lichtemission
Was nutzt die Luciferase?
Luciferase katalysierte Reaktion des Luciferins zum Oxyluciferin
Oxidation zum Oxyluciferin bewirkt Lichtemission mit λmax = 560 nm
Wie läuft die Strangsynthese ab?
Strangverlängerung durch Polymerase, Freisetzung von Pyrophosphat
ATP Herstellung aus Pyrophosphat durch Sulfurylase
Lucierfasereaktion (Emission)
Abbau der nicht verwendeten dNTPs
Wiederholung
Wie läuft das 454 Verfahren ab?
1. Fragmentierung der DNA durch Zerstäubung unter Hochdruck und „Auffüllung“ von
überhängenden Enden. (300-800 base pairs)
2. Ligation von 2 Adaptermolekülen (je 44 bp) an Enden (B-Adapter mit Biotin)
3. Aufreinigung über Streptavidin beads, dann Bindung an capture beads. (pro bead nur
ein Einzelstrang-molekül)
4. Klonale Amplifikation in Wasser-Öl Emulsion (Emulsions PCR)
5. Aufreinigung durch Biotin-Streptavidin und Sequenzierung in Picotiter-platte (ein bead pro Well)
Was ist der Unterscjied zur Emuslions PCR?
Was ist der Unterschied der Sanger Sequenzierung im Bezug auf die Mutation?
Was ist NGS?
Was ist Third-generation NGS?
hat längere leselängen
schneller
präziser für einzelne moleküle
direkte RNA Sequenzierung
Welchen Einfluss hat die Amplifikation auf die Fehlerrate? Welche Schwierigkeiten gibt es bei der Erkennung genetischer Varianten?
Durch PCR können Fehler in der Sequenz eingeführt werden.
PCR Fehler werden verursacht durch “Misincorporation” von Nucleotiden, durch Amplifikation von Artefakten (Abbruchprodukten) und durch differentielle Amplifikation
Sequenzierfehler durch hohes Rauschen., durch unvollständigen Einbau von Nucleotiden oder unvollständige Entfernung von Schutzgruppen (Illumina).
Erkennung von relativ seltenen genetischen Varianten durch DNA Sequenzierungsfehler und durch Fehler in der PCR sehr erschwert.
In Proben von Tumorgeweben liegen Zellen mit unterschiedlichen somatischen Mutationen vor.
Wichtige Mutationen liegen mit geringer Häufigkeit vor und werden bei der Amplifikation nicht
ausreichend erfasst.
Zudem können Fehler bei der Amplifikation auftreten.
Wie wird die Amplifikation durch Bar coding verbessert?
Ligation der Mutation mit Barcodes
Amplifikation
Sequencing
Fehler werden ausgelesen (mismatches)
Rolling circle Amplifikation zur Reduktion der PCR Fehlerrate
DNA Fragment wird zunächst “zirkularisiert” durch zirkularisierende Ligase. Nicht-zirkuläre DNA wird
durch Exonuclease entfernt. (step 1B)
Amplifikation der zirkulären DNA (Phi29 DNA Polymerase) Fehlerrate 10-100fach niedriger.
Amplifizierte Sequenz wird wiederholt abgelesen.
PCR Fehler werden nach der Sequenzierung durch wiederholte Sequenzierung erkannt.
Fehler bei NGS Sequenzierung
Sequenzierungsfehler vor allem am Ende der abgelesenen Sequenz
Bestimmte Sequenzmotive erhöhen Wahrscheinlichkeit für Fehler (z.B. GG oderwiederholte GGC Motive)
Systematische Fehler in bestimmten genomischen Regionen
Sequenzierfehler erschweren das Erkennen von single-nucleotide polymorphisms (SNP)
Bioinformatics Algorithmen können (zum Teil) Fehlsequenzen erkennen
Was ist Ion torrenzt Sequencing?
Pac Bio Next Generation Sequencing
Extraordinarily long reads:
Depending upon starting library, half of the data are in reads >14,000 base pairs long with the longest reads over 40,000 base pairs.
Extremely high accuracy:
Perform de-novo assembly of genomes and detect variants with greater than 99,999% accuracy. Sequence individual molecules with 99% accuracy at greater than Sanger lengths.
Exquisite sensitivity:
Detect minor variants that are present at a frequency less than 0.1%.
LEISTUNGSKRITERIEN DNA SEQUENZIERUNG
Leselänge eines DNA Fragments (read length)
Durchsatz (through-put) (Sequenzierung pro h oder in einem Gerätelauf in Mega-oder Gigabasen)
Probenbereitung / library generation
Mit oder ohne Amplifikation
Qualität der erhaltenen Sequenz (Fehlerrate)
Mehrfache Sequenzabdeckung( (sequence coverage): Zahl der wiederholten Sequenzierung der gleichen Sequenz
Kosten
QUALITÄT DER ERHALTENEN SEQUENZ
Qualität (Fehlerrate) der erhaltenen Sequenz ist abhängig von Sequenziermethode
und Qualität der Daten.
Durch vergleichende Sequenzierungen von bekannten Sequenzen wurde ein Maß für
die “Qualität “ der Basenzuordnung bestimmt:
SEQUENCE COVERAGE
Für die Qualität der DNA Sequenzierung ist wichtig, wie oft die gleiche Sequenz
sequenziert wurde bzw. wie oft eine Base in einer sequenzierten Sequenz enthalten
war. Man spricht von “coverage” (Abdeckung).
Die durchschnittliche Coverage für ein Genom (oder einer Teilsequenz) kann berechnet
werden nach
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