Herzog

“für die Entdeckung der genetischen Kontrolle der frühen Embryonalentwicklung”

Experiment:

1) Chemische Zufallsmutationen in den Genen

2) Entwicklung der mutanten Fliegen-Embryonen und Larven

3) Analyse der Fliegenlarven unter dem Mikroskop

4) Identifikation des mutierten Gens

==> Entdeckung des Hierarchischen Systems der Entwicklungsgene

• haben Blutgefäße

• Wirbeltiere -> viele Prozesse dem Menschen ähnlich

• legen bis 1000 Eier pro Woche

  • Interaktionsstudien möglich

• Eier und frühe Larfenstadien durchsichtig

• schnelle Entwicklung

• Genetische Regulation und Entwicklungsprozesse zwischen Mensch und Zebrafisch hochkonserviert

Injektion von Transposase mRNA + Plasmid DNA mit Tol2 Elementen

-> Integration ins Genom

-> Keimbahntransmission

(Transposase mRNA wird irgendwann abgebaut -> beendet deren Aktivität)

Alternativ:

- Lineariisierte DNA über Injektion von Plasmid + Restriktionsendonuklease

=> Ineffizient -> deswegen Transposon-Elemente

• Integration in ein essentielles Gen -> letal

• Integration in Heterochromatin -> Silencing des Gens

• Promotor und Enhancer für spezifische Genexpression nötig -> sonst ektopische (wo man nicht will) Expression

  • Für Blutgefäse vaskuläre Promotor und Enhancer

• unterschiedliche Kopienzahl möglich

• Mosaikbildung -> nicht alle Zellen enthalten Transgen -> variable Expression, unvorhersehbarer Phänotyp

Injektion in das befruchtete Ei (Dotter)

1) Injektion von mRNA ==> frühe, gleichmäßige Überexpression (kurz, 24h)

oder

2) Injektion von DNA

• vorrübergehende Mosaike Expression, fängt erst mit expression Embryonaler Gene an

• Integration ins Genom —> Weitergabe an zukünftige Generationen

  
  

oder

3) Morpholino (antisense DNA-Oligo) ==> vorrübergehender Block der Translation

1) Morpholino Oligo mikroinjektion in 1-4 Zellstadium

2) Komplementäre mRNA-Bindung

• Block der Translation (block der Anlagerung des Ribosoms)

• Modifizierung des Splicen

• Inhibition miRNA maturation

==> Morphant larval model (veränderte Lave)

• Morpholino hatte ungewollte Nebenwirkungen im Gehirn -> toxisch

• Stammzellen manipulieren, amplifizieren und zurückinjizieren -> uneffektiv

• jetzt Cas9

=> Genommodifikation erzeugt Mutationen die über Keimbahn weitervererbt werden können

• Einfügen DS-Strang Bruch

• Reparatur durch nicht homologes Endjoning

• Fehler -> hoffen auf Stopp Codon

=> Mutationen müssen angeschaut werden -> haben sie gewollten Effekt

Apelinrezeptoren:

• G-Protein gekoppelte transmembran Rezeptoren

• wichtig für Signal-transduktion

• 2 Gene im Zebrafisch: aplnra und aplnrb

Bild: Wanderung der Zellen in die Mitte für Blutgefäßentwicklung: was passiert, wenn man die Gene ausknockt?

1) Knockdown

==> Dosierungs-abhängiger Effekt

• Knockdown von Rb scheint größeren Effekt zu haben als der von Ra

• Allgemein: Je mehr Allele geknock-downt wurden, desto schlimmer ist der Effekt

==> aplnra und aplnrb regulieren die Wanderung der Endothelzellen

Transplantation von:

0) Wildtyp Zellen in Wildtyp-Akzeptor

• Es findet Zellwanderung statt

1) Apelin-Rezeptor-mutierten Zellen in Wildtyp-Akzeptor

• Es findet keine Zellwanderung statt

2) Wildtyp Zellen in Apelin-Rezeptor-mutierten Akzeptor

• Es findet Zellwanderung statt

==> Apelin-Rezeptoren werden Zell-autonom für die Zellwanderung benötigt, hängt nicht an anderen Zellpopulationen

• Apelin wird während und vor der Angioplasten Migration expremiert

=> Problem: Angioblasten in denen es Apelin knock-down gibt wandern trotzdem zur Mittellinie

- Elabela Mutanten haben Defekte bei der Wanderung zur Mittellinie

-> in homozygoten Mutaten kaum Wanderung zur Mittellinie

• sekretiertes Peptid

• ist vor und während Angioblastenmigration exprimiert

• wird in lateralen Plattenmesodem exprimiert

1) flh und ntl

• flh und ntl Zebrafisch-Embryo-Mutanten zeigen verminderte Zellmigration in die Mittellinie

• flh und ntl mutanten haben keinen Notochord

==> Signale des Notochord führen Angioblasten zur Mittellinie

2) noto und ta

• ta-Mutante: Zellen differenzieren sich nicht und schaffen die Wanderung in die Mitte nicht

==> flh/ta ablatiert (entfernt) das Notochord und ntl/noto verhindert die Differenzierung

• Expression von ela in der Mittellinie ist stark reduziert

=> wie können wir beweisen, dass ela der Faktor für Migartion ist

• Überexpression v. ela in Notocord-Mutaten müsste Migration zur Mittellinie retten

-> Überexpression v. ela reicht um Wanderung wieder möglich zu machen

=>Knock-out von ela hat gezeigt das es benötigt wird

=> Überexpression hat gezeigt, dass es ausreichend ist

Motogen

= ich kann laufen

Chemoattractand

= ich bewege mich entlang eines Gradenten zu bestimmtem Platz

- Ela Transgen mit Hitzeshock Promotor

• inkubiert man Embryos in 39° Wasser -> Hitzeshock Promotor aktiv => viel Ela

• Festgesetzter Radius von 5 µm um Ela expremierende Zellen

  • wenn Zellen in diesen Radius kommen -> Angioplasten wandern zu Ela expremierenden Zellen

=> ela überexpremierte Zellen können Angioplaten in Noto Mutanten anziehen

=> Ela ist chemoattraktives Signal

• Besteht aus besonders dicht gepackten Endothelzellen

• Ist eine Neurovalskuläre Einheit

• Ist essenziell für die Homeostase (=Gleichbleiben) und Schutz des Hirnes

• Kann in ihrer Dichte variieren

• Neurodegenerative Erkrankungen haben mit Veränderung/Öffnung der BBB zu tun

==> Medikamente kommen schlecht ins Hirn

• glut-1 = Glukose-1-Transporter

• claudin5b = Zell-Zell-Kontakt in BBB

• Farbstoffe in unterschiedlichen größen in Blutbahn

• Welche können Diffundieren -> zeigen, dass sie nicht ins Hirn gelangen

• Verdichtung ab 2,5 Tagen

  • dicht für alles <2kD

Verlust von Wnt/β-catenin Signaltransduktion führt zu Vaskulären Defekten und Hirn-Blutungen

- Zelle die Wnt empfangen kann produziert konstant β-catenin

Signaltransduktion aus:

- β-catenin wird phosphoryliert -> ubiquitiniert -> abgebaut

Signaltransduktion an:

- Wnt bindet -> Inaktivierung des Komplex für phosphorylierung von β-catenin -> Akkumulation v. β-catenin -> bindet Transkriptionsfaktoren

Pharmakologische Inhibition:

- Axin wird durch IWR-1 stabilisiert

Problem: um Mesoderm zu machen ist Wnt nötig

==> bei Färbung von Wnt gibts super viel Hintergrundfärbung

Option 1) axin2 Bac: Venus-Pest

• axin = Target Gen von Wnt, Teil des Destruction-Komplex von Wnt

• Anstelle von Axin wurde Venus-Startcodon eingesetzt

  ==> Unter der Regulatorischen Kontrolle von Axin, machen wir Venus als fluoreszenz Marker

  ==> Immer wenn Axin gemacht wird, gibts Signal

• ABER: zu stabil

  ==> PEST-Sequenz dran, für schnelleren Abbau (Halbwertszeit 30-60min)

  
  

Option 2) 14xTCF binding sites

• Konstrukt mit 14xTCF binding sites, lox, STOP, lox, dGFP

• dGFP = destabilisiertes GFP

• STOP wird am zu untersuchenden Ort entfernt

• Expression durchgehend aktiv, erst runter wenn Blutgefäße verbunden sind

• Konnte nur untersucht werden, weil das Signal wieder abgebaut wird

• hsp70I = Hitzeshock-Promotor

• mCherry = Signal

• dnTcf = Bindet DNA, aber β-catenin nicht

  ==> dominant-negativ

• + Zugabe von cre mRNA (an den gewünschten Orten), die an loxP STOP rausschneidet

• Anastomose = Verbindung zwischen 2 Leitungsbahnen

• ist nötig

• in WT 1 Kontakt -> Aufgabe der restlichen Sprouts

-> dauer in WT ca. 1,5 - 2 h

• Mutante viele Kontakte -> kein Lumen

-> dauer in IWR-1 bis zu 6 h ohne annähernd so gutes Ergebnis

Versuchsaufbau: Knock down von Wnt/β-catenin durch Überexpression von TCF/ IWR

1) Spezifizierung der Tip-Zellen: Wnt/β-catenin nötig

2) Einwanderung der CtA (Gehirnkapillare): Wnt/β-catenin nicht nötig

3) Verbindungen der CtA: Wnt/β-catenin nötig

4) Lumenbildung: Wnt/β-catenin nötig

Block des Wnt/β-catenin Signalwegs durch Überexpression von DN-TCF

==> Mehr Verbindungen zwischen den CtAs

==> Weniger Verbindungen mit der Arterie

==> Rückbildung mancher CtAs

1) Färbung von VE-cadherin und esema sowohl im WT, als auch in Wnt-blockierten Mutanten:

• mRNA Mengen sind ca. gleich

=> Nein, VE-cadherih und Esama sind nicht durch Wnt/β-catentin Signaling transkriptionell reguliert!

2) Antikörper-Protein-Färbung:

• WT lokalisieren VE-cadherih und Esama in Zell-Zell-Verbindungen

• Mutanten nicht

=> Wnt/β-catentin Signaling ist wichtig für die Lokalisierung von VE-cadherin und Esama

• Mit Inhibitor keine Zell-Zell-Kontakte in jungen Mäusen vorhanden

• wenn Wnt erst in adulten Mäusen blockiert wurde -> super Zell-Zell-Kontakte

=> Zell-Zell-Kontakte werden nicht wieder aufgelöst

=> Zeitlich abhängiger Prozess

S1pr2-Signalling: Öffnen der VE-cadherin-Verbindungen, dass Leukozyten durch Zellschicht durchwandern können

S1pr1/3-Signalling: Schließen der Verbindungen, durch Rekrutierung von mehr VE-cadherin, dass keine Leukozyten wandern können

Wenn Wnt-Signalling geblock ist UND Rac1 geblockt wird

-> Rettung des WT-Phänotyps

=> Wnt blockiert normalerweise Rac1

=> Wenn Wnt geblockt wird, wird Rac1 Überexprimiert und der Mutanten-Phänotyp stellt sich ein

Ein vaskulärer Promotor mit CA-Rac1 würde es unmöglich machen eine Linie heranzuziehen, weil Überexpression von Rac1 zytotoxisch

-> Fische würden sterben

Gal4/UAS System:

=> Erst wenn die Linien zusammen verpaart beginnt die konstitutiv aktives von Rac1

=> Du kannst dir Fisch anschauen, ohne ihn großziehen zu müssen

Allein die Überexpression von Rac1 reicht aus, um den gleichen Phänotyp zu generieren, wie bei der Blockierung vom Wnt-Signalling

=> Wnt-Signalling limitiert Rac1-Aktivität während der Gehirnkapillar-Angiogenese

Ab Blockierung des Wnt Signallings (auch in WT Fisch) -> S1pr1-Signalling “übernimmt”

WT -> Zell-Zell-Verbindungen

Wenn Wnt blockiert ist -> Keine Zell-Zell-Verbindungen

Wenn Wnt + S1pr1/3 blockiert sind -> Zell-Zell-Verbindungen -> Rettung