Ober

-Endodermales Organ (Innerstes Keimblatt, immer von Mesoderm umgeben)

-Entgiftung

-Gallensekretion

-Gylkogenspeicher

-Aminosäureproduktion

-Regenerationspotenzial

• anterior-posteriore Anordnung der Organe stimmt weitgehend überein

• Molekulare Mechanismen und Signalwege sind weitgehend konserviert

Entwicklung in Zebrafisch:

• entwickelt sich auf Dotter

  • gut für Lebendzellbeobachtungen

• entwickelt sich in 4 statt 10 Tagen

Organ”domänen” werden entlang der anterior-posterior Körperachse etabliert

Zusammenspiel aus Wnt/FGF4/BMP Signalen (posterior) und Wnt-Antagonisten (anterior) bestimmt die Spezifizierung

-Aus multipotenten foregut- Zellen:

• gut

• liver

• pancreas

• swim bladder

-Herzmesoderm induziert Leber im benachbarten ventralen Vorderdarm

-Mesoderm aus anderen Regionen nicht

-dorsaler Vorderdarm ist nicht “hepatogen”

-> Leberkompetenz muss vorher etabliert worden sein

1. Hepatogene Kompetenz

   • Endoderm intrinsisch

1. Leber Spezifikation

   • Signale vom Mesoderm

• FoxA = Transkriptionsfaktor im Vorderdarm -> essentiell

• Übermäßige Gabe von Spezifizierungsfaktoren induziert kein zusätzliches Lebergewebe

=> nur wenn beide TR (FoxA1 und A2) keine Leber

=> kombinierte Aktivität beider Faktoren essentiell

• sie öffnen geschlossenens Chromatin -> Gene für Leberentwicklung können abgelesen werden

Signalmolekül-Kandidaten:

-Bmp4 im Septum transversum Mesenchym (STM)

-Fgf1/2 im Herzmesoderm

Experiment:

Vorderdarm Endoderm => Keine Leber

Vorderdarm Endoderm + Herzmesoderm oder STM => Leber

Vorderdarm Endoderm + Bmp4 oder Fgf => Leber

(Bmp4-Maus-Mutanten zeigen nur leicht gestörte Leberbildung,

Fgf-Mutanten mit Leberbildungs-Phänotyp gibt es bisher nicht)

Forward genetics

• Ziel: Mutanten mit Phänotypen in zu untersuchenden Geweben

• Mutagen -> ungerichtete Mutationen -> screenen auf Mutanten

• Mutiertes Gen molekular biologisch bestimmt -> positional cloning

Erstellen v. mutagenen Linien:

prometheus-Mutanten zeigen homozygot lebensfähige Fische mit entweder keinen, oder einer sehr kleinen Leber

Färbung:

wnt2bb-Gen ist in prometheus Mutanten mutiert

Da es auch ohne wnt2bb ein bisschen Leber/Pankreas gibt, gibt es noch einen weiteren Faktor

Zellen in WT angefärbt -> in 1000 Zellstadium 15 - 20 Zellen entnommen -> in 1000 Zellstadium der Prometeus Doppelmutante injiziert

• Sind die Zellen im späteren Embryo im Mesoderm oder Endoderm exprimiert?

Ergebnisse

=> Wnt2bb Signal kommt aus Mesoderm

Beweis:

• Doppelmutante welche kein Endoderm bildet

=> Anlagen für Leber trotzdem vorhanden

Knockdown-Experiment:

Knockdown von Wnt2bb -> kleine Leber

Knockdown von Wnt2 -> kleine Leber

Knockdown von beidem -> keine Leber

=> Wnt2 kompensiert partiell das Wnt2bb Defizit

=> Wnt2 und Wnt2bb sind notwendig für die Leberspezifizierung

Überexpressions-Experiment:

Überexpression von Wnt2 mittels Hitzeshock-Promotor=> Größere Leber

Ektopische Expressions-Experiment:

Wnt2bb + Wnt2 ektopische Expression kann Leberschicksal in “falschem” Gewebe induzieren

=> Wnt2bb + Wnt2 sind ausreichend für Leberexpression

leberwurst kodiert für Cdx1b, das macht Sfrp5, einen negativen Regulator für Wnt

=> Fgf und Cdx1b müssen Rest vom Darm davor “schützen” auch Leber zu werden, indem sie Wnt-Signal inhibieren

(herausgefunden durch Knockout Mutanten)

• benötigen Signale -> in Modellorganismen identifiziert

• reprogramieren von pluripotenten Zellen zu Endodermzellen

a) Kontaktabhängig

• Signalzelle hat membrangebundenes Signal

• Zielzelle hat Rezeptor

b) Paracrin

• Signalzelle gibt Faktor (lokalen Mediator) ab

• Zielzelle mit Rezeptor

c) Synaptisch

• Präsynapse gibt Neurotransmitter ab

• Postsynapse mit Rezeptor

d) Endocrin

• Endocrine Zelle gibt Hormon in Blutbahn ab

• Zielzelle sitzt an anderem Ort -> Rezeptor

=> Es gibt membrangebundene Rezeptoren (Notch) und Liganden, die mit EGF repeats in den Extrazellularraum ragen

Bei Kontakt und ziehender Kraft werden negativ regulierende Regionen des Rezeptors auseinandergezogen, und NICD (=Notch IntraCellular Domain) wird in der Receiver-Zelle frei

-NICD aktiviert dann die Expression von target genes

Ziehende Kraft kommt durch die Vesikel-Einstülpung im Sender zustande. Vesikel schließt Rezeptor und Ligand ein

Equivalent precursors:

Eine Zelle hat sowohl Notch Rezeptor, als auch Ligand. Dabei ist die Zelle sowohl Sender, als auch Empfänger. Beide sind gleichwertig, und inhibieren sich gegenseitig. Die Aktivierung des Rezeptors aktiviert die Genexpression, welche wiederrum die Einstülpung am Liganden inhibiert.

Symmetry breaking:

Eine Zelle hat sowohl Notch Rezeptor, als auch Ligand. Die Zelle ist dabei entweder Receiver oder Sender. Je nachdem inhibiert der Ligand den Rezeptor mehr (beim Sender), oder andersherum.

-Zelle 1 besitzt ein transmembran-Protein mit Ephrin und eins mit einer Rezeptor-bindenden Domäne

-Zelle 2 besitzt ein transmembran-Protein mit Eph und eins mit einer Ligand-bindenden Domäne

=> Die 4 Domänen bilden ein Tetramer

-> in Zelle 1 dimerisieren cytoplasmatische tails und es gibt ein reverses Signal

-> in Zelle 2 dimerisieren Kinasen, phosphorylieren, und das Signal wird weitergeleitet

• Neuronpopulatonen projizieren von bestimmter Region im Nervensystem zur Zielregion

• erhalten Nachbarschaft aufgrund fortlaufender sensorischen Karte aufrecht

=> essentiell für visuelle Representation von visuellen Informationen im Gehirn

• Streifenassay nach Bonhoeffer

• Gradient von EphA3-Bindungsfaktor im Tectum

Temporale retinale Axone:

• Hohes EphA3 -> Chemorepulsion von hohem ephrinA2 im posterioren Tectum

Nasale retinale Axone:

• niedriges EphA3 -> insensitiv gegenüber dem hohen ephrinA2 im posterioren Tectum

• Zellrepulsion

• Zell-Zell-Adhäsion

• Zellproliferation

• Gewebegrenzen ausbilden

• Zellmigration

• Axonale Wegfindung

Es gibt asymmertrische Expression von Signalmolekülen (zb. Lefty2)

LPM = Laterales Plattenmesoderm

Antwort: LPM-Polarität und asymmetrische LPM-Wanderung

Beispiel Leber:

Durch EphrinB1 und EphB3b

Färbung:

=> Expression von EphB3b in Lateralem Plattenmesoderm

=> Expression von EphrinB1 im Darm

Knockdown von EphrinB1/EphB3b:

=> Kein gerichteter Auswuchs der Leber

GAL/UAS-System mit EphrinB1:

=> Kein gerichteter Auswuchs der Leber

Im Wildtyp werden die Hepatoblasten elongiert mit der Zeit

=> Knockout von EphrinB1 oder EphB3b -> weniger Zellen elongiert

Die Interaktion von EphrinB1 und EphB3b miteinander steuert die Morphogenese

• Während der Knospung

  
  

Filopodienartige Zellfortsätze:

• etablieren Kontakte zwischen Hepatoplasen und LPM

Lamellopodiaartige Zellfortsätze:

• deuten auf Zellbewegung hin

Unkonventionelle Zellfortsätze:

• Gezielte Signalübertragung

Zellumhüllung

Geziehltes Targenting für Zellmigration

Zellrekrutierung

• haben gegensätzliche Wirkung

• Zellabstoßung steuert die aktive Hepatoblastenmigration der assymetischen Positionierung der Leber

Mechanismus:

• bidirektionale EphrinB1 und EphB3b Signale

  • Migration der Hepatoblasen

  • LPM Bewegung

• Zellrepulsion

  • gerichtete Hepatoblasenmigration

  • rechts-links assymetische Organmorphogenese

• long distance Zellkontakte

  • Mediieren das Signaling

• EphrinB1

  • mediiert EphB3b abhängige und unabhängige Aktivitäten