8. Methoden DNA und RNA

• Art des Probenmaterials (Pflanzen, tierisches Gewebe, Insekten)

• zu isolierender Probenmenge

• Probenzahl (paralleler Aufschluss mehrerer Proben)

• Ultraschall

• Osmotische Verfahren

• Freeze-Thaw Verfahren

• Mörser und Pistill

• Kugelmühlen (Kugeln aus Zirkonia oder Edelstahl

• Blender (schnell rotierende Messer, 1ml - 100L)

• DNA sehr langes homogenes Molekühl, teilweise sehr dicht gepackt

• Fragmentierung sehr leicht möglich

• Trennung von anderen zellulären Komponenten (RNA, Proteine, Lipide,…)

• bauen DNA (RNA) ab

• DNasen einfacher zu inaktivieren (Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen ➡️ + EDTA)

  • Autoklavierung + “Backen” (> 8h bei 180 Grad)

  • Behandlung mit Biethylpyrocarbonat (DEPC)

• Schaffung eines seperaten Teils im Labor für DNA/RNA-Arbeiten

• Lyse (Aufbrechen der Zelle/des Zellkerns) & Homogenisierung (Detergenz)

• Denaturierung von Proteinen und Nukleoprotein-Komplexen (Protease/Denaturierungsagenz)

• Inaktivierung von endogenen Nukleasen (sog. DNasen)

• Isolierung und Aufreinigung der DNA (Abtrennung von Proteinen, RNAs,…)

• Ionische Detergentien (SDS)

  • brechen hydrophobe Bindungen und Wasserstoffbrücken auf

• Chaotrope Reagenzien

  • Harnstoff, Guanidinhydrochlorid, Phenol

  • entfernen Hydrathüllen von Biomolekülen

  • positiv geladene Salze können Salzbrücken bilden

• Reduzierende Agenzien

  • zum Aufbrechen von Disulfidbindungen

• Salze

  • interagieren mit geladenen Gruppen und erhöhen die Proteinlöslichkeit

• Wärme

  • bricht Wasserstoffbrückenbindungen und unpolare Bindungen auf

• Protease (Proteinase K) und RNase

• Organische Extraktion

• Aussalzen / Fällung

• Selektive Bindung von DNA an Säulchen,…

• DNA ist polar (negativ geladen durch Phosphatrückgrat) ➡️ unlöslich in organischen LM

• Traditionell: Phenol / Chloroform Extraktion

• DNA ➡️ wässrigen Phase (oben)

• Denaturierte Proteine ➡️ organische Phase (unten)

• 1:1 Phenol:Chloroform oder 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl-Alkohol

• denaturiert Proteine

• ➡️ Bildung einer festen Interphase zwischen organischer und wässriger Phase

• erhöht die Dichte der organischen Phase

verhindert Schaumbildung

• am häufigsten verwendet

• 70%-EtOH (1 vol DNA Lösung + 2 vol 96% (v/v) Ethanol)

• Ethanol entzieht der DNA die Hydrathülle, negativ geladene Phosphatgruppen biilden zB. mit Na+ ein Salz

• DNA wird präzipitiert ➡️ Reinigungsschritt

• unerwünschte Stoffe werden entfernt

• DNA/RNA wird konzentriert

• Überführung in neuen Puffer möglich

• Finale Konzentration 40-50% (v/v)

• häufig eiskalt, 30 min bei -20 Grad

• Zentrifugation, waschen mit 70% Ethanol

• Zucker und NaCl werden mitgefällt

• nicht ganz so effizient

• lässt sich nur schwer wieder entfernen

• stört viele Enzymreaktionen

• Anionenaustauscher (Dextran, Cellulose mit positiv geladenen Gruppen)

  • Stärke der Bindung für DNA, RNA und Proteine ist unterschiedlich und vom pH und der Ionenstärke des Puffers abhängig

• Silikat-Säulchen

  • binden in der Gegenwart hoher Konzentrationen chaotroper Salze spezifisch DNA, die nach dem Waschen problemlos mit H2O oder TE-Puffer elutiert und direkt weiterverwendet werden kann

+ Schnell, einfach, keine organischen LM, automatisierbar

- DNA Fragmentierung

• stark sensibel gegenüber Scherkräften

• Entstehen beim Vortexen, wiederholten Auf- und Abpipettieren,…

• meist:

  • CTAB-Fällung

  • Zugabe von EtOH im Überschuss

  • DNA fällt aus und kann auf einem Glasstäbchen aufgerollt werden

  • vorsichtig trocknen, lösen in H2O für mehrere Tage bei 4 Grad

• Isolation der Gesamten RNA

• Anreicherung der polyA-RNA

• cDNA Synthese

  • Einsatz in Microaarays

  • Erstellung einer cDNA Bank

  • PCR, RACE

• Ähnliche Prinzipien wie bei der DNA Isolierung

• ABER: hohe Sensitivität gegenüber RNasen

  • Handschuhe

  • eigener Laborbereich

  • eigene Reagenzien (RNase frei, nur für diesen Zweck)

  • Autoklavieren von Gefäßen, dann “backen”

  • eventuell Verwendung von DEPC vor dem Autoklavieren ➡️ Inaktivierung der RNasen, zerfällt in H2O und EtOH

• möglichst frische Proben

• möglichst schnelle Extraktion

• DNA-Modifizierungen (unerwünscht) werden durch hohe DNA Konzentrationen gehemmt

• Lagerung der DNA:

  • aufgereinigte dsDNA bei 4 Grad in H2O oder TE Puffer

  • erst bei Lagerung > 1 Woche ➡️ -20 Grad

• zur Bestimmung der Menge, aber auch der Qualität (Reinheit)

• Methoden unterscheiden sich in:

  • Arbeitsaufwand

  • Kosten

  • Genauigkeit

• Aromatische Strukturen absoribieren Licht bei bestimmter Wellenlänge

  • Basen der Nukleinsäuren bei 260nm

  • AS mit aromatischen Seitenketten bei 280nm

• Spektrophometer

  • unspezifisch über weiten Wellenlängenbereich (UV-Bereich notwendig)

  • spezifisch für DNA / RNA / Proteine

• Unterschied v.a. in der notwendigen Probenmenge

  • Klassischer Spektrophometer (50ul - 1ml)

  • Nanodrop (0.5 - 5ul)

• Verbrauchsmaterial

  • Quarz-Küvette (Spektrophometer)

  • keines außer Pipettenspitze

• aus der optischen Dichte (Absorption) bei 260nm (OD 260)

• Agarosegel

• Fluorometrische Bestimmung (Hoechst 33258)

• 0.5 - 2 %-ige Agarosegele für DNA-Fragmente zwischen 300 und 5000 Basen

• große DNA-Fragmente durchlaufen Agarosegele langsamer als kleine

• Färbung der DNA

  • Ethidiumbromid

  • SYBR Green I, SYBR Green II, OliGreen oder PicoGreen (höhere Empfindlichkeit, aber teuer)

• Größenstandards (DNA-Leiter)

• Quantifizierung “semiquantitativ” über entsprechende Software

• RNA neigt zur Uasbildung von Sekundärstrukturen (Formaldehyd oder DMSO und Glyoxal)

• RNA-Größenmarker

• gesamt RNA besteht zu 80% aus rRNA

  • Eukaryonten 18S, 28S rRNA

• mRNA unterschiedlich lang ➡️ Schmier

• Ethanol (Banden ziehen Schweife hinter sich)

• Natriumchlorid (Banden nach oben gebogen)

• Ammoniumacetat (Größenverschiebung, gebogene Banden)

• CTAB (keine distinkten Banden)

• RNA Proben QC vor Microarray oder qPCR-Experimenten

• DNA-Analyse vor PCR/mPCR- und RT-PCR-Produkten

• Proteinexpressionsanalyse

• Proteinreinheit während der Aufreinigung

• Zellbasierende Analyse in Gen-Silencing oder Apoptose

1. Die Probe bewegt sich vom Probengefäß durch die Mikrokanäle

2. Die Probe wird in den Trennkanal eingespritzt

3. Die Probenkomponenten werden elektrophoretisch getrennt

4. Die Komponenten werden durch eingelagerten Fluoreszenzsfarbstoff detektiert und in gelartige Bilder (Banden) und Elektropherogramme (Peaks) übersetzt

stellt eine zentrale Drehscheibe bei molekularbiologischen Arbeiten dar

• Denaturierung

  Trennung der doppelsträngigen Ausgangs-DNA (Template-DNA)

• Anlagerung (Annealing)

  kurze DNA-Stücke (Primer, Sense-Antisense) lagern sich an komplementäre Sequenzen der Ausgangs-DNA an

• Elongation (Extension)

  thermostabile DNA-Polymerase baut die vorhandenen dNTPs komplementär zur Ausgangs-DNA beginnend bei den Primern ein (72 Grad)

• notwendig, damit man nicht nach jedem Denaturierungsschritt die Polymerase neu zugeben muss (Nobelpreis für K. Mullis)

• Saiki et al. Thermus aquaticus (thermophiles grampositives Bakterium, heiße Quellen) ➡️ Taq-Polymerase

• Vielzahl an Polymerasen

  • Proofreading Polymerase (mit Exonnuclease Aktivität)

  • Phusion (fusioniert mit dsDNA Bindedomäne ➡️ sehr lange Amplifikate und hohe Synthesegeschwindigkeit)

üblicherweise vom Hersteller der Polymerase mitgeliefert

• Tris-HCl

• MgCl2, KCl

• dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

• typischerweise zwischen 15 und 30 Basen lang (- 150 Basen)

• selbst designed

• kommerziell erhältlich

• Annealing Temperatur (3 - 5 Grad unter der Schmelztemperatur, ergibt sich aus Basensequenz und Länge des Primers)

• Theromcycler

  zyklisch arbeitende Thermoelemente

• Gradientencycler

  Temperaturbereich (z.B. wenn die genaue Annealingtemperatur nicht bekannt ist)

• Speedcycler

  schnellere Heizraten (10Grad/s statt 2Grad/s)

• mehrere gleiche PCR Ansätze

• Annealing Temperatur für jede Probe unterschiedlich

• Temperaturgradient

• wenn unspezifische Amplifakte auftreten

• bei niedriger Effizienz der Amplifikation

  • Erste PCR wie Standard PCR

  • 1/10 bis 1/100 der des ersteb PCR Ansatzes für 2.PCR mit neuen Primern, die innerhalb des amplifizierten DNA-Bereiches liegen

• verschiedene Bereiche der Ausgangs-DNA durch unterschiedliche Primerpaare amplifiziert

2 Reaktionen, die nacheinander im gleichen Reaktionsgefäß stattfinden

• Reverse Transkription (Reverse Transkriptase wandelt RNA in cDNA (complementary DNA) um

• PCR: Amplifikation der cDNA

• Thermocycler + Fluoreszenzphotometer

• Messung der Menge der gebildeten DNA schon während Amplifikation in Echtzeit am Ende jedes Zyklus (real time PCR)

  • bei herkömmlicher PCR nur am Ende der Gesamtreaktion (Endpunkt-PCR)

• Kombination von RT und qPCR (RT-qPCR) erlaubt die Quantifizierung von mRNA

• SYBR Green = unspezifisch

• TagMan = spezifisch

• Analyse und Klonierung von DNA Fragmenten

• Molekulare Diagnostik

  • Identifizierung von Bakterien, Parasiten,…

  • Erkennung von Mutationen/Polymorphismen

  • Forensiche Medizin

  • Vaterschaftstest

  • Lebensmittel Analytik

  • Nachweis von genetisch veränderten Organismen

Sequenzierung nach Sager (Didesoxy-Methode)

• Denaturierung der DNA

• Sequenzprimer bindet an DNA

• dNTP (ein Teil davon fluoreszenzmarkiert ohne OH-Gruppe am 3´ Ende) werden eingebaut

• Auftrennung nach Größe

• Identifizierung einer bestimmten Nukleinsäure aus einem Gemisch an Nukleinsäuren

  • Southern Blot (DNA)

  • Northern Blot (RNA)

• Herstellung einer Sonde

• Hybridisierung

Markiertes DNA Molekül, das an eine komplementäre Sequenz binden und diese sichtbar machen kann

• 30 - 40 Basen bis zu 500 Basen

• Markierung

  • Radioaktiv (32P)

  • Indirekte Markierung (Molekül wird eingebaut, das später einem Antikörper nachgewiesen werden kann; Biotin, Fluorescein, Digoxygenin)

  • Fluorophore (Cy3, Cy5)

Absichtliche Sequenz-spezifische Zusammenlagerung zwischen 2 komplementären Nukleinsäure-Strängen

• in vitro

• einer der Partner ist auf einer festen Oberfläche immobilisiert

• Anlagerung der NS

• Fixierung an der Trägeroberfläche (ca. 2h bei 80 Grad, UV-Crosslinking)

• Blocken der freien Oberflächen (Absättiigung mit fremder DNA)

• Eigentliche Hybridisierung der Sonde (42 Grad über mehrere Stunden)

• Abwaschen der überschüssigen Sonde

• Detektion