9. Methoden Proteine

1. Ausgangsmaterial

   Entfernen von Gewebe- und Zelltrümmern

   • Homogensiation

   • Filration

   • Zentrifugation

2. Rohextrakt

   Entfernen von anderen Zellbestandteilen

   • Fällung der Proteine

   • Aufnehmen in neuem Puffer

   • Dialyse

   • Konzentrierung

3. Proteinextrakt

4. Chromotographie

   Entfernen von anderen Proteinen

   • Ionenaustauscher

   • Hydrophobe Interaktion

   • Affinitätschromatographie

   • Gelfiltration

5. Quantifizierung von Proteinen

• Ausgangsmaterial?

• Welche Menge des Protein wird benötigt?

• Wie rein muss das gesuchte Protein sein?

• Muss das Protein noch biologisch aktiv sein?

• Vorerfahrungen (eigenes Labor, Literatur)?

• Mechanische AV

• Nicht mechanische AV

• Wiederholtes Einfrieren und Auftauen (tierischen Gewebekultur)

• Hypotoner Schock (Erythrozyten und Retikulozyten)

• Autolyse (Hefezellen)

• Enzymatische Lyse (Hefezellen, gram-positive und negative Bakterien)

• bauen Protein ab (Hydrolyse der Peptidbindungen)

  • Endopeptidasen (Trypsin ➡️ Arg, Lys, Chymotrypsin ➡️ Trp, Tyr, Phe, Pepsin,…)

  • Exopeptidasen (nicht spezifisch, bauen Protein vom Ende her ab)

• äußerst stabil

  • normale Funktion: Abwehr von Pathogenen

• in unterschiedlichen Mengen im Ausgangsmaterial vorhanden

• Phenylmethylsulfonylflurorid (PMSF)

• Leupeptin-Hemisulfat

• Pepstatin A

• Phenanthrolin

• Benzamidin HCl

• Aprotinin

• Trypsin Inhibitpr

• bei Isolation von Proteinen aus Pflanzen oder Pilzen

• enthalten Polyphenole (Quercentin, Kaffeinsäure,…)

• Polyphenol-Protein-Aggregate ➡️ unlöslich, fallen aus

• Oxidation durch Polyphenoloxidasen, Peroxidasen,…

• Zusatz von synthetischen Polymeren (PVPP, PVP)

• Zusatz von Oxidationshemmern (Diethyldithiocarbamat (DIECA), Dithiothreitol (DTT),…)

• möglichst physiologische Umgebung (pH, Salzgehalt,…)

• Lagerbar, preiswert, keinen Einfluss auf nachfolgende Analyse (Phosphatpuffer nicht geeignet für ATP-abh. Enzyme)

Tris-HCl

Phosphatpuffer

Boratpuffer

Zwitterionische Pufferlösungen

• abtrennen von Zell- und Gewebetrümmern (Filtern, Zentrifugation) ➡️ Rohextrakt

• Fraktionierung

  • Entfernung löslicher Zellbestandteile (KH, Nukleinsäuren,…)

  • Fraktionierung des Proteingemisches

  • reversible oder irreversible Proteinfällung (Abtrennung unerwünschter Substanzen, Konzentrierung, Umpuffern)

    • Ammoniumsulfat (Verlust der Hydrathülle)

    • Polyethylenglykol

    • Butanol, Aceton

    • Trichloressigsäure

    • Saltung out (hohe Konzentration an Salzen)

    • Salting in (destilliertes Wasser)

• Diffundierung über eine semi-permeable Membran

• Niedermolekulare Teilchen (Salze,…) können diffundieren, große (Proteine) nicht ➡️ Pufferaustausch

• einstellen eines Gleichgewichts (mehrere Stunden bei 4 Grad)

• Ultrafiltrationszelle

• effizient, schnell

• durch Druck wird eine Flüssigkeit über eine semipermeable Membran gepresst

• Auftrennung eines Gemisches durch wechselwirkung eines Stoffes in der mobilen Phase mit einer stationären Phase

  • Flüssigkeitschromatographie (WW mit Säule)

    • Ionenaustausch-Chromatographie (Proteinladung bestimmt wie lange das Protein interagiert)

    • Affinitätschromatographie (sehr spezifische Interaktionen, zB: Enzym-Ligand)

    • Gelfiltration (poröse Matrix, große Mol wandern schnell durch, kleine verfangen sich in der Matrix)

• Detektion der Proteine (Chromatogramm)

  • UV-Detektor

  • Fluoreszenzdetektor

• Absorption bei 280nm ➡️ ungenau

• Farbstoffe, die mit Protein reagieren

  • Proteinbestimmung nach Bradford

  • Proteinbestimmung nach Lowry

  • BCA-Test (Bicinchoninsäure)

• Bindung von Coomassie Brilliant Blue an Proteine (eig. Arg)

• Absorptionsmaximum bei 595nm

• Proteine bilden mit Cu2+ im alkalischen Milieu enen Komplex

• Reduktion des Cu2+ zu Cu+

• bilden mit BCA einen Farbkomplex

• Absorptionsmaximum bei 562nm

1. Proteinlösung

   Konzentrieren und Entsalzen

2. SDS PAGE, natitive PAGE, IEF, Blue native PAGE

Gellauf wird durch folgende Eigenschaften bestimmt

• Größe

• Ladung (abh. vom pH Wert)

• Form

• Native PAGE

• SDS-PAGE

• IEF

• Blue native PAGE

Auftrennung nach

• Größe, Form, Ladung

kein Zusatz

Anwendung

• Enzymaktivität bleibt erhalten. Einige Proteine können aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität im Gel nachgewiesen werden

Auftrennung nach

• Größe (Maskierung anderer Eigenschaften)

Zusatz von

• SDS

Anwendung

• Das am häufigsten verwendete Verfahren

• trennt die Peptide nur nach Größe auf

Verfahren

• Denaturierung der Proteine (Aufkochen)

• Umhüllung mit Detergens (SDS) zur Maskierung der Ladung

• DTT spaltet bei Hitze Disulfidbrücken

Auftrennung nach

• Ladung (isoelektrischer Punkt)

Zusatz von

• Ampholyte

Anwendung

• meist als erste Dimension bei der 2D-Elektrophorese

• trennt die Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt auf

Verfahren

• pH-Gradient wird im PA-Gel erzeugt (Ampholyt-Gemische für bestimmten pH-Bereich)

• Proteine laufen im Gel so weit bis der umgebende pH-Wert ihrem isoelktrischen Punkt entspricht

Auftrennung nach

• Bindungsfähigkeit für Coomassie

Zusatz von

• Coomassie

Anwendung

• meist als erste Dimension bei der 2D-Elektrophorese

• Probenvorbereitung

• Herstellen des Gels

  • Ansetzen der Gellösung (Acrylamid, Bisacrylamid, APS, TEMED)

• Auftragen der Proben

• Gellauf

• Sichtbarmachen der Proteinbanden im Gel

• Acrylamid

• Bis-Acrylamid

• APS (Starter)

• TEMED (Katalysator)

• Auftragen einer gleichen Menge an Protein

• Anlegung von SPannung (100 - 200V)

• Stromstärke ca. 12 - 15 mA

• Coomassie

• Silberfärbung

• Kupfer

• Fluoreszenzfarbstoffe

Färbung sehr von AS-Zusammensetzung der Proteine abhängig

• sehr sensitiv

• nur sehr saubere Chemikalien und Gefäße verwenden!

  
  

• Negativfärbung

• die Gelmatrix wird gefärbt, die Banden bleiben klar

• eine dunkle Pappe wird zum Betrachten unter das Gel gelegt

• sehr teuer

• Beispiele sind Sypro-Farbstoffe, Deep Purple oder Cy-Farbstoffe

• Antigen und Antikörper (polykklonal) werden in Lösung vermischt

• Bildung von Aggregaten ➡️ fallen in Abhängigkeit von Konzentration an Antigen und Antikörper aus

  • Optimale Konzentration in der Äquatorialzone

• Zentrifugation

• Membranen

• Plastikoberflächen

• Chromatographische Trägermaterialien (Agarose, Sepharose)

• Magnetic Beads

• Gold

• Enzyme

• Fluoreszierende Substanzen

• Biotinylierung

• Radioaktivität

• Gold

• Transfer der Proteine vom Gel auf Membran im elektrischen Feld

  • Wet Blot

  • Semi-Dry Blot