MG-1

• kurze Generationszeiten (20-30 min)

• hohe Zelldichte (100-300 OD)

• günstige Kulturmedien

• Genetik und Biochemie sehr gut charakterisiert

• Vielzahl von Epxressionsplasmiden

• Viele Mutantenstämme

Nachteile:

• Produktion komplexer Proteine z.B Antikörper schwierig

• keine Glykosylierung

• Endotoxine -> LPS kann an Protein haften

• kovalente Bindung zw. zwei Schwefelatomen (von Cysteinmolekülen einer Aminosäurekette)

• Ermöglichen 3D Strukturen —> Tertiär - und Quartärstruktur

Kompartimente:

• Cytoplasma: —> reduzierendes Milieu —> keine Disulfidbrücken

• Periplasma: —> oxidierendes Milieu —> Disulfidbrücken

Expressionsvektor = Zirkuläres Plasmid

• Promotor: Initiationsfaktoren, RNA-Plymerasen binden hier

• Repressor: wird dauerhaft exprimiert, blockiert Promotor

• SD: Shine Dalgamo Sequenz —> Bindestelle für Ribosomen auf mRNA

• coding sequence: Gensequenz

• Terminator: Stoppsignal für Polymerase

• Replicon: Origin of Replication (ORI), Ort der Vervielfältigung des Plasmids

• Resistenzmarker: Antibiotika-Resistenz —> E.Coli wird gezwungen das Plasmid zu behalten um in AB-Lösung zu überleben

• RBS: Ribisomenbindestelle, Robosom braucht Start- und Stop-Codon

• pUC:

  • wtColE1 -> pMB1 -> pUC

  • high copy number: Plasmid: 500-700 Kopien/Zelle

  • hoher Gendosiseffekt —> Problem: Proteinaggregation

• p15A:

  • low copy number: Plasmid: 10-12 Kopien/Zelle

  • niedriger Gendosiseffekt —> Gut für: Proteine mit langer Faltungszeit —> Intermediäre Stadien hydrophob —> begünstigt Aggregation —> weniger Proteine —> Aggregation weniger wahrschienlich

Phänomen, dass zwei verschiedene Plasmide – abhängig vom Replicon – nicht stabil innerhalb einer Zelle erhalten werden können

—> Es gibt auch kompatible Plasmide z.B. ColE1 & p15A, brauchen aber verschiedene Resistenzen damit beide bestehen bleiben

pTUM4:

• Helper Plasmid —> hilft Proteinen bei Faltung und Disulfidbrücken

• Chaperone: (Proteine die bei Faltung helfen)

  • fkpA

  • surA

• Ausbildung von Disulfidbrücken

  • dsbA

  • dsbC

• ori

• cat —> Resistenz Chloramphenicol

Resistenzmarker verleiht AB-Resistenz

• Ampicilin: inaktiviereung von Entymne, die Peptidoglykanstränge der Zellwand vernetzen

• Kanamycin: wirkt auf Proteinbioynthese (Bindung am Ribosom)

starker Promotor:

• 10-30% Protein am Gesamtzellprotein

• hohe mRNA Konzentration —> viel Biosynthese —> kann zu Aggregation führen —> Problem!

schwacher Promotor:

• Gut für schlecht faltende Proteine —> Vermeidung von Aggregation durch hydrophobe Oberflächen

Generell wichtig:

• minimale Basaltranskription —> Hintergrundtranskription ohne Indikator —> wichtig bei Herstellung von für E.Coli toxischer Proteine —> Promoter muss dicht sein

• Induzierbarkeit —> einfach zu ökonomischen Bedingungen

Vektor:

• pET-Vektor: hybrider Promotor: T7-/lac-operator

• benötigt DE3-Phagenfragment in E.Coli Genom (besondere Stränge)

• lacI durch pET und E.Coli schwach exprimiert; lacIq -> 10x mehr Repressor —> Tetramere machen beide Systeme dicht —> Repression

• ori: Origin of Replication

• resistance: AB-Resistenz

• T7-Promotor: Bindung von T7-Polymerase

• lac-operator: chemisch induzierbar

• MCS: multiple cloning site —> Einfügen des gewünschten Gens

• T7-Terminator: Stoppsignal für T7-Polymerase

Induktion:

• IPTG —> lacI-Tetramer verlässt lac-operator —> Promotor offen

• E.Coli interne Polymerase baut T7-Polymerase (oben) —> T7-Polymerase bindet an T7-promotor —> Transkription der Targetsequenz

• T7-Polymerase —> 5 x schneller als E.Coli Polymerase