MG-2

• basieren auf araBAD Promotor —> Unterdrückung von Hintergrund-Expression

• lineare Induktion —> steigende Arabinose-Konzentration —> keine alles oder nichts Induktion wie bei den meisten anderen

• O1 O2 = Bindestellen für AraC;AracC-Dimer —> DNA Schleife —> Repression

• Arabinose —> bindet an AraC —> Konformationsänderung —> Bindung an O1 und I —> Transkription

• Chemisch:

  • Derivate lac Promotor (IPTG)

  • tet Promotor: Anhyrotetracyclin

  • araB Promotor: L-Arabinose

• Thermisch:

  • cspA Promotor: Temperatur = 15 Grad —> Induktion

  • pL Promotor: Repressor instabil bei T > 37 Grad —> Induktion

• Mangel:

  • phoA Promotor: Absenkung der Phosphatkonzentration im Medium

• Resistenzmarker verleihen Antibiotika-Resistenz —> “zwingt” E.Coli das Plasmid zu behalten

• Häufig verwendete:

  • Ampicilin

  • Kanamycin

  • Chloramphenicol

  • Tetracyclin

• Inhibierung der Proteinbiosynthese durch:

  • Kanamycon

  • Chloramphenicol

  • Tetracyclin

• Ampicilin —> Inaktivierung von Enzymen, die Peptidoglykanstränge der Zellwand vernetzen

• Problem: Abbau des Ampilicins durch freigesetzte beta-Lactamase oder unter sauren Bedingungen bei hohen Zelldichten —> Plasmidverlust

• (Verlangsamung durch: Carbenicilin)

• Diffusion —> Cytoplasma (CP) —> hemmt Peptidyltransferase-Reaktion an 50-S

• Resistenz durch Acetylierung durch CAT (Chloramphenicol-acetyl-transferase) im CP

• dauerhafte Expression von CAT im CP

• Aminoglycosid-Antibiotika (2-3 Zuckerreste)

• Bindung an Ribosom —> inhibieren Translation —> hemmen Zellwachstum

• Resistenz: Modifikation der AB-Moleküle im CP (eins von):

  • N-Acetylierung

  • O-Phoshorylierung

  • O-Adenylierung

    
    

• vierfacher Tetrazenring mit polaren Seitengruppen

• Geringe Konzentration —> Bacteriostatisch

• Hohe Konzentration —> Bakterizid

• Bindet zweiwertige Kationen (besond. Mg2+) —> hemmt Proteinbiosynthese —> verhindert Bindung der Aa-tTRNA an der A-Stelle des Ribosoms

• Resistenz: aktives, Energie-anhängiges Transportsystem, welches AB aus der Zelle pumpt

  • Liegt auf einem Transposon

  • Abwesenheit von Tetracyclin —> kaum Expression von TetA (Pumpe)

  • Anwesenheit von Tetracyclin —> bindet an TetR —> starke Expression von TetA

• Affinitätstag —> verschiedene, meist kurze Aminosäuresequenzen —> markieren (“tag”) von Proteinen

  • Expressionsverfolgung

  • Erleichterung der Reinigung

  • Einfluss auf Löslichkeit (Faltung von Proteinen)

• Small Affinity Tags (kurze Peptidsequenzen)

  • kommerziell erhältliche AK —> einfache Detektion

• Non-peptide Fusion-Partner

  • e.g. Maltose-Binding-Protein (MBP)

  • erhöht Löslichkeit —> gut für langsam faltende Proteine

• Stimulus-responsive tags

  • stimulus —> Protein reversibel fällen/aggregieren

    • beta-roll: Calcium

    • ELP: T-shift (Temperatur)

• enzymatisch: Thrombin, Factor Xa / TEV mit entsprecehnder Proteaseschnittstelle

• chemisch:

  • pro: billig, leicht zu entfernen

  • con: giftig, harsche Reaktionsbedingungen

Zellhülle wird zerstört, um Bestandteile zu analysieren

Methoden:

• French press

• Ultraschall

• phoA-Promotor —> niedrige Phosphatkonzentration —> Induktion

• Experiment: drei Medien

  • M -> LB-Medium (Phosphat drin)

  • M-P -> LB-Medium ohne Phosphat

  • M+P -> LB-Medium mit limitertem Phosphat

• Ergebniss:

• Plasmidverlust —> Expression Genen/Repressoren —> Zelltod

  • e.g. hok/sok —> Hok -> membranschädigend

• Komplementation —> Deletion/Mutation essentielles chromosomales Gen, intakte Kopie auf P

  • e.g. probA

  • —> auf Medienzusammensetzung achten