MG-3

• Stoppt Transkription an der richtigen Stelle —> sonst wird ganzes Plasmid zu mRNA

• stabilisiert die mRNA

• Rho-abhängig: (sehr selten)

  • hexameres Rho-Protein bindet an mRNA bei Terminator -> Ablösung der mRNA vom Template

    • ATP-abhängig

    • Trennung der H-Brücken zw. komplementären DNA- & RNA-Strängen

• Rho-unabhängig: (häufiger)

  • symmetrische Sequenz -> hairpin/stem-loop -> Auseinanderfallen von DNA, RNA und Enzym

    • gelb: Stamm, grün: Loop

• Shine-Dalgarno (SD)

• Start-Codon

• Termination: UAA (E.coli), UGA, UAG

Signalpeptid:

• z.b. dsbA/C

• wird abgespaltet danach

• hohe Ausbeuten an löslichem Protein

• einfache Plasmidkonstrukte

• Problem: häufige Bildung von Inclusion Bodies (Aggregation)

  • PBS verlangsamen —> weniger

• Inclusion Bodies rückfalten —> manchmal aufwendig

• reduzierendes Milieu —> keine DSB

• Proteolyse wahrscheinlicher

• N-Terminus kann heterogen sein (Met wird nicht immer entfernt) —> Problem: Manche können es noch haben, andere nicht

• Niedrigere Temperatur

• Koproduktion von Faltungshelferproteinen

• Produktion von Fusionsproteinen (z.B. MBP)

• Wachstum unter osmotischem Stress

• Protease-defiziente E.Coli Stämme

• Mutagenese von Protease Schnittstellen

(3 wissen reicht)

1. Proteinsequenz in DB -> DNA

2. Expressionsvektor festlegen

   1. cytoplasmatische: z.B. pET21

   2. periplasmatische: z.B. pASK-IBA

3. Klonierungsschnittstellen einfügen

   1. z.B. Ndel 5’, HindIII 3’

4. Gensequenz optimieren

   1. His Tag

   2. 5’ und 3’ Primer-Komplemente —> einfache PCR

5. Gen bestellen