Für was steht SPR?
Surface Plasma Resonance
Was macht die SPR?
Misst die Änderung der Oberflächendichte und nimmt diese zeitlich auf.
Was ist ein Plasmon?
Der fließende Strom der in einem Metall fließt.
Wird gemessen indem Strom in einem bestimmten Winkel in eine Goldschicht induziert wird
Nach welchem Prinzip funktioniert die SPR?
Lichtquelle strahlt elektromagnetische Welle durc ein Prisma auf die Probe (Goldschicht) aus
Durch die Anregung des Oberflächenplasmons kommt es zur Veränderung des ausgestrahlten Lichtitensität
Es kommt zu Resonanz = Winkeländerung
> Wenn eine Änderung an der Grenzfläche (Winkel etc.) vorgenommen wird, ändert sich das SPR Signal
Wie erfolgt die Auswertung bzw. Interpretation der SPR Analyse?
Es werden die Winkelunterschiede gemessen
Messung am Energieminimum
Erstes Diagramm zeigt die Veränderung der Winkel in Abhängigkeit der Konzentration
Zweites Diagramm zeigt die zeitliche Auflösung
Wie genau kann SPR messen?
kann mM (schwache Affinitäten) bis nm/pM messeb
Was kann die SPR noch, v.a. im Gegensatz zur Thermodynamik?
Misst Assoziation und Dissoziation
Die Kinetik zeigt den Mechanismus
Von was ist die Assoziation bei der Residenzzeit abhängig?
Von der Höhe der Barriere
Was sind Limits der SPR Technologie?
Es kann zu Löslichkeitsproblemen kommen
Es kann zu Abweichungen der WW kommen bei einfachen Moddeln
Der Massentransfer ist begrenzt
Was macht ITC?
Misst den Strom der zur Kühlung verbraucht wird
Woher kommt der Temperaturanstieg eines Systems?
Exotherme Reaktion
Pufferbedingungen wie z.B Salze die sich durch ihre Gitterenergie erwärmen
Was ist die Entropie?
Maß für die Unordnung eines System
Was sind Ursachen für die Erhöhung der Entropie?
Affinität
Enthalpie
Stochiometry
Wo kann man die Paramter der ITC ablesen?
Warum ist die Stochiometry so wichtig?
Zeigt die Anzahl der Interaktion
Wie kann man den Mechanismus oder die Enzymkinektik untersuchen?
Mechanismus: SPR mit Ligand
Enzymkinetik: Kompetitivität z.B Elisa
Für was steht ITC?
Isothermal Titration Calormetry
Was sind Vorteile der ITC?
Keine Änderung am Protein
Breites Anwendungsspektrum in der Arzneimittelherstellung
Einfach zu etablieren, schenll durchzuführen
Umfassender biophysikalischer Datensatz für molekulare Wechselwirkungen und Stabilität
Label-freie methoden mit breiter Detektionsmethoden
Was sind die grenzen der ITC?
Verunreinigungen
Beschränkungen der Probeneigenschaften
Durchsatz
SPR vs. ITC?
Was sind die Grundsätze der Thermodynamik?
Wie berevhnet man die Association kobs?
Welche Rolle können biophysikalische Methoden in der frühen Phase der Wirkstofffindung und Entwicklung spielen?
Beitrag zur Überprüfung von publizierten Daten
Mechanistische Untersuchungen zur Interaktion potentieller Wirkstoffmoleküle
Nutzung als orthogonale Methode zur Vermeidung von falsch positiven Hits aus anderen Screens
Welche Screenings Strategien können Sie benennen? Wo spielen hierbei biophysikalische Methoden eine wichtige Rolle?
• HTS - High Throughput Screenings
• Focused Screen
• Fragment Screen
• Structural aided drug Design
• Virtual Screen
• Physiogical Screen
Können Sie verschiedene biophysikalische Methoden nennen?
• Kalorimetrische Methoden, wie ITC und DSC,
• Surface Plasmon Resonance
• MicroScale Thermophorese
• NMR
• Fluoreszenzspektroskopie
• Dual Polarisationsspektroskopie, Acustic Wave Sensor, Thermal Shift
Assay, Differential Scanning Fluorimetry
Beschreiben Sie kurz in einfachen Worten die Schritte in der
Proteinstrukturlösung durch Röntgenkristallographie
Kristallisation: Das Protein wird in eine Lösung gebracht, aus der es langsam kristallisiert. Das bedeutet, die Proteinmoleküle ordnen sich in einem regelmäßigen Muster an und bilden einen festen Kristall.
Röntgenbestrahlung: Der Protein-Kristall wird mit einem Röntgenstrahl bestrahlt. Die Röntgenstrahlen werden von den Atomen im Kristall abgelenkt und erzeugen ein Beugungsmuster.
Beugungsmuster erfassen: Die abgelenkten Röntgenstrahlen werden von einem Detektor erfasst, der ein komplexes Muster von Punkten aufzeichnet. Dieses Beugungsmuster enthält Informationen über die Positionen der Atome im Protein.
Datenverarbeitung: Mit Hilfe von Computern und mathematischen Methoden wird das Beugungsmuster analysiert. Dies erlaubt die Berechnung der dreidimensionalen Elektronendichte im Kristall.
Modellbau: Basierend auf der Elektronendichtekarte wird ein Modell der Proteinstruktur erstellt. Wissenschaftler passen ein Modell der Aminosäuresequenz in die Elektronendichtekarte ein, um die genaue Position jedes Atoms im Protein zu bestimmen.
Verfeinerung: Das Modell wird durch wiederholte Berechnungen und Vergleiche mit dem Beugungsmuster verfeinert, bis es die experimentellen Daten bestmöglich erklärt.
Am Ende dieses Prozesses hat man ein detailliertes Bild davon, wie das Protein in drei Dimensionen aussieht, was helfen kann, seine Funktion und Wechselwirkungen besser zu verstehen.
Ein Protein liegt im Komplex mit Liganden vor. Ein Ligand hat die
Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante von 10-4 s-1 und der zweite Ligand 0.1 s-1.
Berechnen Sie die Residenzzeiten des Komplexes.
τ1=10−4s−11=104s
τ2=0.1s−11=10s
In einer Reaktion oder Interaktion die unter pseudo 1.Ordnung abläuft gilt
die folgende Bedingung: kobs = kon* [Ligand] +koff . Erklären Sie den
Unterschied zwischen kobs und kon in der Formel. Errechnen Sie die beiden
kobs mit einer kon von 103 M-1s-1 und 107 M-1s-1 bei einer angenommenen
Ligandenkonzentration von 1 μM und einer koff 10-3 s-1.
Wie funktioniert das Sitting drop verfahren?
Das Wasser diffundiert aus dem Tropfen in die Lösung
Konzentration steigt
Was beeinflusst die Kristallisation?
Temperatur
Zeit
pH-Wert
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