Wie kann ich Proteine synthetisieren?
in vivo, in vitro, rekombinant
Mit welcher Methode kann man die Proteinexpression regulieren, bzw. auch verhindert werden?
Expressionsvektoren, mit lac Operon u. IPTG
->lac Operon steuert Expression des Genes, das für Zielprotein kodiert
Abwesenheit IPTG: kein IPTG vorhanden ist oder hinzugefügt wird, bleibt lac Repressor an den Operator gebunden und verhindert die Transkription des Zielgens -> RNA-Polym. Kann nicht an Promoter binden -> Transkription blockiert -> Protein nicht exprimiert .
Anwesenheit: IPTG hinzugefügt -> Proteinproduktion gestartet, da sich Repressor v. Operator löst
Gegeben ist Mischung aus 3 Proteinen, welche nachstehende Eigenschaften aufweisen. Nennen sie 2 geeignete chromatographische Trennungsmethoden, die man in Serie schalten kann, um alle 3 Proteine am Ende getrennt vorliegen hat. (Nennen sie den pH-Wert der verwendeten Puffer)
Protein A: 10 kDa, pI = 4
Protein B: 12 kDa, pi = 8
Protein C: 80 kDa, pi = ?
Ionenaustauschchromatographie (IEC)
-Proteine basieren auf pI u. Nettoladung bei bestimmten pH-Wert getrennt
-Pufferbed.:
Puffer mit einem pH-Wert von ca. 6 -> Protein A (pI = 4) neg. geladen (bindet an Matrix bei Anionen-Austausch) und Protein B (pI = 8) pos. geladen (bindet an Matrix bei Kationen-Austausch)
Größenausschlusschromatographie (SEC)
-Proteine basierend auf ihrer Größe (molekulares Gewicht) getrennt
neutralen, physiologischer pH-Wert (pH 7)
-Protein C (80 kDa) aufgrund seiner Größe zuerst eluieren, gefolgt von den kleineren Proteinen (Protein A 10 kDa wenn Kationen-Austauscher benutzt
o. Protein B 12 kDa - wenn Anionen-Austauscher gewählt)
Aufreinigung:
Prot. A (70 kDa, pI: 8,5)
Prot. B (12 kDa, pI:8)
Prot. C, pI: 4) mit 2 nacheinandergeschalteten Chromatografiearten.
Beschreiben und dabei nennen welchen pH-Wert die jeweiligen Puffer haben
Puffer mit einem pH-Wert von ca. 6 -> Protein A & B (pI = 8,5 ;8) pos. geladen (bindet an Matrix bei Kationen-Austausch) und Protein c (pI = 4) neg. geladen
- Benutzung Kationenaustauscher: pos. geladene Proteine A u. B binden an Matrix, C wird eluiert
-Protein A (70 kDa) aufgrund seiner Größe zuerst eluieren, gefolgt von den kleineren Proteinen (Protein B 12 kDa)
Protein nach der Aufreinigung mittels IEC u. SEC danach ebenfalls noch in hochmolekulares PEG gebracht werden (Dialyse über semipermeable Membran). Was ist der Zweck?
Proteinlsg. zu konzentrieren (PEG im äußeren Dialysebad erzeugt osmot. Druck -> H2O aus Proteinkammer gezogen)
Entfernung kleiner Moleküle: unwersünschte Salze u. Pufferbestandteile entfernen u. gg. gewünschten Puffer ausgetauscht
Zuletzt geändertvor 2 Monaten