Chromatographie:
was wird damit gemacht?
Mechanismus?
was ist HPLC
dessen Aufbau
durch Chromatographie (= Farbe- Schreiben) können Stoffe getrennt werden, aufgrund von WW/ Verteilung des Analyten in der mobilen + stationären Phase.
Mechanismus:
Adsorption
Verteilung
Ionenaustausch
HPLC = High Performance Liquid Chromatography
Geräteausstattung, die hohe Drücke (bis zu 100 MPa) aushält
automatisierter Betrieb
HPLC- Geräteanforderung (2 Stück)
Pumpsysteme:
kontrollierte Durchflussrate
möglichst geringe Druckschwankungen
Dichtigkeit des Systems (Schläuche, Vebindungen, …)
Vorrichtung zum Austreiben von gelösten Gasen
= Degasser (im Detektor)
isokratische Elution/ Gradientenelution (=Zusammensetzung ändert sich im Verlauf)
Einspritzvorrichtung:
einspritzen am oder Nahe am Säulenkopf in die strömende mobile Phase
vordefiniertes Volumen (Probenschleife) oder “Autosampler”
Stationäre- Phase
was für Phasen gibt es?
wie sieht die dazugehörige mobile Phase aus?
was für eine Chromatographie- Art?
zeichne stationäre Phasen
Phasen- Arten:
Normalphasen- LC
=> Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid
polare stationäre Phase
nicht- polare mobile Phase
Verteilungschromatographie
Umkehrphasen- LC
=> reversed- Phase
=> modifizierte Trägermaterialen
nicht- polare stationäre Phase
C8, C18, Phenyl, Cyano,…
kovalent gebundene Silyl- Derivate
polare mobile Phase
Wasser + MeOH/ Acetonitril
pH- Wert beachten, Puffer verwenden
welche stationäre Phase ist üblich bei:
Ionenaustauschchromatographie
Ausschlusschromatographie
Affinitätschromatographie, konjugierte Proteine
mobile Phasen
-> welche Substanzen sind üblich?
-> welches Wasser wird wenn verwendet?
-> wie kann man gelöste Gase entfernen?
-> wie wird der pH Angepasst?
mobile Phase:
wässrige mobile Phase mit organischen LM:
-> hochreine org. Fließmittel (HPLC Qualität), frei von Stabilisatoren
gereinigtes + filtriertes Wasser “zur Chromatographie R”
gelöste Gase können entfernt werden mit:
He
Ultraschall
Degasser
pH- Anpassung in wässriger Phase durch Puffer- Systeme
Detektoren
nenne 4 Arten
Auswertung
was ist ein Chromatogramm?
was ist ein Peak?
Formel die für gaußförmige Peaks gilt
was ist die Retentionszeit
und das Retentionsvolumen
Formel
Totzeit
Chromatogramm
= graphische Darstellung eines Detektionssignals als Maß für die Konzentration des eluierten Analyten. Im Idealfall:
Gauß´sche Verteilungskurve über einer Basislinie
Peak
= Detektionssignal einer einzelnen Komponente
Peak wird durch die Peakfläche (AUC), Peakhöhe (h), Peakbreite in halber Peakhöhe (wh) oder Peakbreite am Wendepunkt (wi) definiert.
-> Peakhöhe wird beeinflusst durch Konz., WW, Elutionskraft
-> Gaußsche Verteilungskurve
Retentionszeit (tR):
= Zeit, dir für dir Elution einer Komponente benötigt wird
Retentionsvolumen (VR):
= V der mobilen- Phase, welches für die Elution einer Komponente benötigt wird.
kann aus Retentionszeit und der Durchflussrate (F) in ml/ min berechnet werden.
Totzeit (tM):
= Zeit, die für die Elution einer nicht zurückgehaltenen Komponente benötigt wird.
was ist der Retentionsfaktor?
tR = Retentionszeit
tM = Totzeit
Wie berechnet man die Anzhal theoretischer Böden?
was ist das?
wovon ist die Plattenzahl abhängig?
wie berechnet man den Symmetriefaktor?
was liegt vor bei As
> 1,0
< 1,0
-> recht Tailing dargestellt
Auflösung
Relative Retention
Systemeignung (Eignungsprüfung)
für was gut?
wie sieht diese aus?
ist eine Prüfung der Systemeignung
um angemessene Trennleistung zu gewährleisten
umfasst:
Retentionsfaktor
Symmetriefaktor
Signal- Rausch- Verhältnis
jedes Chromatographie- System ist individuell. Komponenten und Bedingungen dürfen angepasst werden, wenn die Kriterien der Systemeignung noch erfüllt werden.
-> was sind das für erlaubte Anpassungen?
-> was nicht?
HPLC, isoelektrische Elution:
Zusammensetzung Fließmittel
pH der wässrigen Phase
Salzkonzentration im Puffer
Durchflussrate
-> NICHT: stationäre Phase, Säulendimension, Detektor- Wellenlänge, Temperatur, Einspritzvolumen
HPLC, Gradientenelution
geringe Änderung der Fließmittelzusammensetzung wenn:
Systemgeeignet
Hauptpeak im 15%- Bereich
Endzusammensetzung stärkere Elutionskraft als isokratische
Durchflussrate nur bei anderer Säulendimension
Temperatur nur +- 5°C bei Arbeitstemperatur!
-> NICHT: pH, Puffer- Salzkonz., stationäre Phase (Teilchengröße), Detektorwellenlänge, Einspritzvolumen
quantitative Bestimmung:
was wird NICHT berücksichtigt?
was ist ein Detektor- Respons?
“ externe standard Methode
“ interne standard Methode
Normalisierung
Kalibrierung
Peaks, die vom LM, Reagenzien oder von der mobilen Phase/ Probenmatrix stammen, werden nicht berücksichtigt.
Detektor- Respons = empfindlichkeit des Detektors, Signalintensität pro Konz.- Einheit der Substanz
Externer- Standard- Methode = Vergleich der Signale in Untersuchungslösung mit Referenzlösung
Interner- Standard- Methode = gleiche Menge Standard, der vom Analyten gut getrennt eluiert, werden in Untersuchungslösung und Referenzl. gegeben.
es werden die Verhältnisse der Peaks zwischen Analyt und interner- Standard verglichen.
-> Anforderungen: unreaktiv, stabil, keine Verunreinigungen, andere Retentionszeit
Normalisierung = %- Gehalt eines Bestandetils bezogen auf die Gesamtfläche aller Peaks (ohne LM)
Kalibrierung = meist lineare Beziehung zwischen Signal (y) und Konzentration (x)
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