Vorlesung: Flüssigchromatographie

• durch Chromatographie (= Farbe- Schreiben) können Stoffe getrennt werden, aufgrund von WW/ Verteilung des Analyten in der mobilen + stationären Phase.

• Mechanismus:

  • Adsorption

  • Verteilung

  • Ionenaustausch

• HPLC = High Performance Liquid Chromatography

  • Geräteausstattung, die hohe Drücke (bis zu 100 MPa) aushält

  • automatisierter Betrieb

• Pumpsysteme:

  • kontrollierte Durchflussrate

  • möglichst geringe Druckschwankungen

  • Dichtigkeit des Systems (Schläuche, Vebindungen, …)

  • Vorrichtung zum Austreiben von gelösten Gasen

    = Degasser (im Detektor)

  • isokratische Elution/ Gradientenelution (=Zusammensetzung ändert sich im Verlauf)

• Einspritzvorrichtung:

  • einspritzen am oder Nahe am Säulenkopf in die strömende mobile Phase

  • vordefiniertes Volumen (Probenschleife) oder “Autosampler”

• Phasen- Arten:

  • Normalphasen- LC

    => Siliciumdioxid oder Aluminiumoxid

    • polare stationäre Phase

    • nicht- polare mobile Phase

    • Verteilungschromatographie

  • Umkehrphasen- LC

    => reversed- Phase

    => modifizierte Trägermaterialen

    • nicht- polare stationäre Phase

      • C8, C18, Phenyl, Cyano,…

    • kovalent gebundene Silyl- Derivate

    • polare mobile Phase

      • Wasser + MeOH/ Acetonitril

    • pH- Wert beachten, Puffer verwenden

• mobile Phase:

  • wässrige mobile Phase mit organischen LM:

    -> hochreine org. Fließmittel (HPLC Qualität), frei von Stabilisatoren

  • gereinigtes + filtriertes Wasser “zur Chromatographie R”

  • gelöste Gase können entfernt werden mit:

    • He

    • Ultraschall

    • Degasser

  • pH- Anpassung in wässriger Phase durch Puffer- Systeme

• Chromatogramm

  = graphische Darstellung eines Detektionssignals als Maß für die Konzentration des eluierten Analyten. Im Idealfall:

  Gauß´sche Verteilungskurve über einer Basislinie

• Peak

  = Detektionssignal einer einzelnen Komponente

  • Peak wird durch die Peakfläche (AUC), Peakhöhe (h), Peakbreite in halber Peakhöhe (wh) oder Peakbreite am Wendepunkt (wi) definiert.

    -> Peakhöhe wird beeinflusst durch Konz., WW, Elutionskraft

-> Gaußsche Verteilungskurve

• Retentionszeit (tR):

  = Zeit, dir für dir Elution einer Komponente benötigt wird

• Retentionsvolumen (VR):

  = V der mobilen- Phase, welches für die Elution einer Komponente benötigt wird.

  • kann aus Retentionszeit und der Durchflussrate (F) in ml/ min berechnet werden.

• Totzeit (tM):

  = Zeit, die für die Elution einer nicht zurückgehaltenen Komponente benötigt wird.

tR = Retentionszeit

tM = Totzeit

-> recht Tailing dargestellt

• ist eine Prüfung der Systemeignung

• um angemessene Trennleistung zu gewährleisten

• umfasst:

  • Retentionsfaktor

  • Auflösung

  • Symmetriefaktor

  • Signal- Rausch- Verhältnis

• HPLC, isoelektrische Elution:

  • Zusammensetzung Fließmittel

  • pH der wässrigen Phase

  • Salzkonzentration im Puffer

  • Durchflussrate

  -> NICHT: stationäre Phase, Säulendimension, Detektor- Wellenlänge, Temperatur, Einspritzvolumen

• HPLC, Gradientenelution

  • geringe Änderung der Fließmittelzusammensetzung wenn:

    • Systemgeeignet

    • Hauptpeak im 15%- Bereich

    • Endzusammensetzung stärkere Elutionskraft als isokratische

    • Durchflussrate nur bei anderer Säulendimension

    • Temperatur nur +- 5°C bei Arbeitstemperatur!

  -> NICHT: pH, Puffer- Salzkonz., stationäre Phase (Teilchengröße), Detektorwellenlänge, Einspritzvolumen

quantitative Bestimmung:

• Peaks, die vom LM, Reagenzien oder von der mobilen Phase/ Probenmatrix stammen, werden nicht berücksichtigt.

• Detektor- Respons = empfindlichkeit des Detektors, Signalintensität pro Konz.- Einheit der Substanz

• Externer- Standard- Methode = Vergleich der Signale in Untersuchungslösung mit Referenzlösung

• Interner- Standard- Methode = gleiche Menge Standard, der vom Analyten gut getrennt eluiert, werden in Untersuchungslösung und Referenzl. gegeben.

  • es werden die Verhältnisse der Peaks zwischen Analyt und interner- Standard verglichen.

    -> Anforderungen: unreaktiv, stabil, keine Verunreinigungen, andere Retentionszeit

• Normalisierung = %- Gehalt eines Bestandetils bezogen auf die Gesamtfläche aller Peaks (ohne LM)

• Kalibrierung = meist lineare Beziehung zwischen Signal (y) und Konzentration (x)