MG-5

Reinigung entfernt nicht vollständig: LPS = negativ geladen, Anionenaustausch-chromatographie -> Abspaltung

Seperate Abtrennung:

• Affinitätschromatographie (EndoTrap)

• Polymyxinsäule

E.Coli Stamm ohne LPS (ClearColi)

Mutagenese = Veränderung von Aminosäuren

Warum:

• Andere Löslichkeit, Stabilität

• Andere Enzymaktivität/Affinität

• Andere Struktur

rational:

• gezielter Tausch von AA an bestimmten Positionen

• Planung anhand von Kristallstruktur

evolutiv:

• zufälliger Austausch —> Screening

rational

• PCR Mutagenese

• Kunkel-Mutagenese

• QuickChange

evolutiv

• Error Prone PCR

• E.Coli Mutatorstamm

• DNA-Shuffling

PCR Mutagenese

• 2 überlappende Mutagenese Primer

• left, right Fragmente

• Primer entfernen

• Denaturieren

• Taq polymerase -> Ligation

• -> Mutiertes Gen

• rein in Plasmidvektor

M13 Phage (P)

• Lebenszyklus

  • P injiziert ssDNA in E.Coli (F Pilus)

  • ssDNA -> dsDNA -> Herstellung aller P-Proteine

  • -> Assembly site -> neue P

• hat IG-Region (intergenic)

  • entspricht ori = Replikationsursprung

  • sorgt für ssDNA Herstellung/Verpackung

IG-Region von M13 —> auf Plasmid packen

• E.Coli + pASK75-strep

• Infektion mit Helferphage M13KO7

  • Schaden in IG -> nicht eigene DNA -> Protein, sondern Plasmid DNA —> hat selbe IG

  • —> Phagen bauen Plasmid ssDNA

  
  

Kunkel-Mutagenese: (—> Phagen)

• Mutagenese durch Mutagenese-Primer mit ssDNA Template

Vorteile:

• zuverlässig

• mehrere Basen gleichzeitig an verschiedenen Stellen bei größeren Genen austauschen

Nachteile:

• dauert ewig

Verfahren:

Erklärung:

• Gen in Einzelstrang DNA (ssDNA):

  • Herstellung durch: pASK75-strep + M13KO7-helper

  • dut- ung- E.Coli:

    • dut: dUTPase -> dUTP anstatt dTTP in DNA

    • ung: entfernt Uracil aus DNA (Uracil-DNA-Glykosylase)

    • —> Phagen-DNA enthält Uracil

    • —> Matritze für DNA-Polymerase

• Anlagerung mutagenes Oglionucleotid

• Verlängerung und Ligation

• dsDNA -> ung+ E.Coli -> U raus

• Originaler Strang wird abgebaut -> nurnoch

schnell, parallel, bis zu 5 Positionen

state of the art

Verfahren:

1. auf 94 Grad -> dsDNA -> ssDNA

2. abkühlen -> mutagenese Primer binden

3. ssDNA -> dsDNA -> 1. -> ssDNA

4. Dnp1 Digestion

   • schneidet methylierte DNA —> Template

   • neue DNA —> nicht methyliert

5. nur neue bleibt übrig

evolutiv

Error Prone PCR:

• Taq DNA polymerase macht mehr Fehler mit:

  • hohe Mn2+ Ionen Konz.

  • unterschiedliche dNTP Konz.

  • Basenanaloga

E.Coli Mutatorstämme:

• eigene Polymerase viel mehr Fehler (5000x)

• Mutationen bei DNA Reperatur Proteinen:

  • MutD5 -> 3’,5’ proofreading (exonuklease)

  • MutS -> erkennt falsche DNA pairs & leitet Reparatur ein

  • MutT -> Nucleosid Triphosphotase