MG-6

• homologe Gene (sehr änhlich) -> DNaseI -> DNA zerteilen (10-20bp)

• Rekombination (PCR-Assembly)

• vorteilhafte Eigenschaften v. beiden -> vereinigen

• smaller than AB (<200aa)

• monomers, AB -> 2 different

• pocket formed by 4 loops, AB -> 6

• potential to form cavities, AB -> flat binding surface

—> genetically modify binding loops -> detect different stuff —> that are Anticalines

Anticalin:

• anti-hapten —> kleine organische Molekül binden

  • rein in die Schleife -> innen mutagenisieren

• anti-protein -> Protein binden

  • Schleife an Protein -> außen mutagenisieren

• Bibliothek, von Anticalinen, die an Kategorien binden können

• z.b. kleine organische Moleküle

  • Herstellung mit zufälligen oligos

1. Welche Aminosäuren sind wichtig für Bindung? -> degenerierte Oligos -> orangene Stellen: NNK, etc.

2. degenerierte Oligos #1-4 + lipocalin cDNA

3. linken Bereich mit #1#2, rechten Teil mit #3#4

4. PCR von 5’ und 3’ Primer, Mittel-Primer

5. Mutageniertes Lipocalin -> zufällige Anticalin DNA nach NNK,etc.

6. Selektion von Anticalinen mit gewünschten Eigenschaften

• Phage Display

  • Gen-Bibliothek auf Plasmide (pBBP20)

    • 1 Gen -> 1 Plasmid -> 1 E.Coli Zelle

  • VCS M13-Helfer-Phage

    • präsentiert Anticalin auf Oberfläche

  • Anticalin auf Oberfläche -> bindet an Ziel

    • —> die zufälligen Anticaline, die man isolieren will

1. Selektierte Anticalin-Gene auf neue Plasmide

   • pBBP22 -> tet Promoter

     • Anticalin-Gen +

     • Albumin-Bindungsdomäne (ABD) +

     • Strep-tag II

1. Kolonie-Filterstapel-Test: -> Stapelt Kolonien & Membranen

   1. Hydrophile Membran

      • E.Coli (leaky) wächst auf Membran

   2. Hydrophobe Membran

      • humanes serum albumin (HSA) Beschichtung

      • auf LB Agarplatte

        • Antibiotikum

        • Eduktor (aTc)

   3. Hydrophile (1) auf Hydrophobe (2) auf Agar

      • Markieren wo 1 auf 2 ist

      • Eduktor (aTc) diffundiert zu E.Coli Kolonie

        • induziert Genexpression

          • Anticalin + ABD = Fusionsprotein

          • Wandert durch Membran (leaky E.Coli)

        • Binding v.

          • HSA und ABD + Anticalin

   4. Hydrophile (1) weg

   5. Hydrophobe (2) + Marker

      • HSA mit ABD + Anticalin

      • Hinzufügen von Marker: (ist blau)

        • Digoxigenin (Target) +

        • BSA +

        • Biotin +

        • Avidin +

        • Alkalische Phosphatase

      • Immer wieder Waschen -> sonst alles blau

      • —> Bindung -> bleibt nach Waschen -> Blaufärbung

   6. Blaufärbung -> Wo auf (1)? -> Gen isolieren

—> Phenotyp / Genotyp - Kopplung!