MG-7

• Ribosome-Display

  • Phage-Display -> man muss Lizenzen kaufen für industrielle Anwendung

  • Eppendorf-tube

    • Anticalin-Library -> Transkription -> mRNA -> Translation am Ribosom -> Anticalin

    • Richtige Bedingungen (Mg2+ Konz.)

      • mRNA + Ribosom + Protein = Komplex

      • “panning” -> Affinitätsmatrix (mit Ligand)

        • nur bindende Komplexe

      • RNA ablösen -> RT-PCR -> Anticalin DNA

    • Wiederholen -> Verfeinern

• Vor:

  • keine Transformation (e.g. Plasmid)

    • Kein Verlust bei Transformation -> mehr Varianten

    • Schnelleres Verfahren

  • zusätzliche Mutationen in jeder Runde (RT-PCR)

  • mRNA-Ribosom-Protein Komplex relativ stabil

• Nach:

  • Protein muss sich richtig falten (wie bei Phage)

  • Protein muss an Ribosom bleiben

  • mRNA muss an Ribosom bleiben

• Zelloberflächen-Display

  • Anker (carrier Protein)

    • Zelloberflächenprotein (ZOP)

  • Passenger-Protein:

    • Fusion von ZOP und Peptid

    • werden auf E.Coli präsentiert

  • meistens mit Grammnegative E.Coli:

    • + Transformationseffizienz

    • - ZOP -> schwächt äußere Membran

• P + L <-> PL

• bzw. (AK + AG <-> AKAG)

• Maß für Affinität: Dissoziationskonstante Kd

  1. Kd = P * L / PL

     • Gleichgewichts-konzentrationen bestimmen

     • je kleiner Kd, desto stabiler der Komplex

  2. dPL/dt = ka * P *L - kd * PL

     • Geschwindigkeitskonstanten kd / ka bestimmen:

       • dt = zeitliche Änderung

       • P + L -> PL = -kd * PL

         • Hinreaktion

         • kd = Dissoziationskonstante

       • P + L <- PL = ka * P * L

         • Rückreaktion

         • ka = Assoziationskonstante

     • Im Gleichgewicht = beides gleich -> dPL/dt = 0

     • Kd = kd / ka

Oberflächenplasmon-Resonanzspektroskopie (SPR):

1. AK auf Goldfilm immobilisieren

   • Winkel messen

2. AG Bindung in Flow cell

   • Winkel anders (Mehr oder weniger Bindung)

1. Sensorgramm auswerten

   • Regerneration = Trennen vom Komplex, zur Not mit Lauge, etc.

1. Experiment wiederholen —> hat Regeneration P/AK degradiert? -> wenn 2. Sensorgramm gleich alles gut

• CM5-Chip: Carboxy-Dextran-Oberfläche

• EDC/NHS

• kovalente Immobilisierung über:

  • -> intermed. Ester

  • primäre Amingruppen d. Proteins

  • Disulfidbrücken

• EDC/NHS-Kopplung (CM5-Chip)

  • über primäre Amingruppen

  • oder Disulfidbrücken

• Streptavidin (SA-Chip) -> braucht biotin

• Nickel-NTA (NTA-Chip) -> kann man wiederverwenden