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Protein-Engineering

ET-AK-Fragen

MF
von Mista F.

Nennen Sie wenigstens fünf der Phasen in der Entwicklung moderner biotechnologischer Wirkstoffe (Proteintherapeutika).

(20,22)

  • Target Assessment 

  • Lead Discovery

  • Lead Optimization

  • Preclinical Development

  • Clinical Trials: Phase 1-3

  • FDA/EMEA Approval


Erläutern Sie kurz die drei in der Pharmaindustrie gebräuchlichen Strategien, um menschliches Wachstumshormon (hGH) in Escherichia coli zu produzieren.

(20,22)

  • Cytosolische Produktion in E.coli:

    • Ersatz des Signalpeptids durch n-terminalen Met-Rest (-> Immunogenität)

    • Extraktion Inclusion Bodies und oxidative Rückfaltung

  • Cytosolische Produktion von Met-Ala-Glu-GH:

    • Met wird abgespalten

      • von Methionin-Aminopeptidase in vivo

    • Nach Isolierung des rekombinanten Proteins wird das Ala-Glu-Dipeptid enzymatisch prozessiert

  • Biosynthese:

    • Biosynthese Präprotein in E.coli -> Sekretion in Periplasma

    • das prozessierte und gefaltete Protein wird nach osmotischem Schock in aktiver Form isoliert


Beschreiben Sie die Vorgehensweise beim Protein-Engineering des hGH-Antagonisten Pegvisomant und erläutern Sie dessen Wirkung im Vergleich zum natürlichen hGH.

(20,22)


  • Gezielte Veränderung anhand hGH-Kristallstruktur

    • mit dimerisiertem Rezeptor (GHR)

    • 8 kombinatorisch generierte Mutationen

      • an der 1. Bindungsstelle

      • -> höhere Affinität für hGHR

    • 1 Punktmutation

      • an der 2. Bindungsstelle (schwächer)

      • verhindert Signalauslösung

        • keine Rezeptordimerisierung


Wie hat man Pegvisomant Plasma-Halbwertszeit effektiv verlängern?

(22)

  • PEGylierung v. Pegvisomant

    • Änderung der PEG-Ketten Anzahl

    • etwa 4-6 -> erhöht Serum-Halbwertszeit


Welche Erkrankung hat den Ersatz des klassisch aus Humangewebe extrahierten Proteins durch das rekombinante hGH beschleunigt und welche Erkrankung wird mit Pegvisomant behandelt?

(20,22)

  • hGH: Übertragung Creutzfeld-Jakob

  • Pegvisomant: Behandlung Akromegalie


Beschreiben Sie die Begriffe "monoklonale, chimäre, humanisierte, humane" Antikörper in jeweils einem Satz und geben Sie dazu jeweils ein Beispiel an, das als Biopharmazeutikum Anwendung findet.

(20,wh22)

Welche Art von Antwort will man bei dieser Form von Protein-Engineering vermeiden?

  • monoklonal:

    • komm von 1 einzigen B-Lymphozyten

    • AK gegen bestimmtes Epitop gerichtet

    • Bsp: Muromomab gegen CD3

  • chimär:

    • konstanter Teil human

    • variabler Teil murin

    • Bsp: Rituximab gegen CD20

  • humanisiert:

    • kompletter AK stammt aus Mensch außer

    • murine CDRs (Complementary determining regions)

    • Bsp: Trastuzumab gegen HER2

  • human:

    • AK komplett aus Mensch

    • Bsp: Adalimumab gegen TNF-alpha

  • Vermeidung von: Immunreaktion auf fremden murinen AK



Nennen Sie die beiden wesentlichen konzeptionellen Schritte bei der Humanisierung des therapeutischen Antikörpers Trastuzumab/Herceptin.


Grundsätzlich bieten sich dabei zwei verschiedene Typen von Templatsequenz an; welchen potentiellen Nachteil hat die in diesem Fall verwendete Sequenz aus heutiger Sicht?

  1. Transplantation der 6 murinen CDRs auf humanes Immunglobolingerüst (CDR-Grafting)

    • Gerüst -> Konsensussequenzen

  2. Rationale Kunkel-Mutagenese -> Affinität steigern

    • alle CDR-Reste aus murin

    • alle FR-Reste aus humanen Konsens


Damals:

  • Konsensussequenz aus verschiedenen humanen V-Domänen

Heute:

  • humane V-Domänen mit hoher Ähnlichkeit zur murinen nehmen


Geben Sie das Indikationsgebiet des therapeutischen Antikörpers Trastuzumab/Herceptin an und beschreiben Sie kurz sein Wirkprinzip, soweit bis heute bekannt (max. 3 Sätze)

(20,22,wh22)

  • Indikation bei metastasierendem Brustkrebs in Kombination mit Chemotherapie (Paclitaxel/Taxol)

  • Wirkprinzip: gerichtet gegen HER2

    • Komplex AK + Rezeptor -> Störung Dimerisierung

    • Clustering v. HER2 (Plasmamembran)

      • Endocytose + lysosomaler Abbau

    • Inhibition der HER2 Proteolyse

      • verbleibender Rezeptor noch stärkere Aktivierung


Welcher Subklasse gehört Trastuzumab/Herceptin an und welche beiden immunologischen Effektorfunktionen schreibt man dieser zu?


Welche beiden Isotypen gelten als 'inaktiv' und worin bestehen deren erst seit kurzem bekannte unerwünschte Eigenschaften?

  • Subklasse: IgG

  • Effektorfunkt:

    • ADCC (antibody dependant cellular cytotoxicity)

    • CDC (complement dependant cytotoxicity)

  • inaktiv:

    • IgG2 -> bindet kovalente Dimere

    • IgG4 -> monovalentes Verhalten



Nennen Sie die beiden vielversprechenden neueren Antikörperwirkstoffe (je eine Bezeichnung genügt) gegen HER2 und beschreiben Sie in jeweils einem Satz deren innovative Wirkprinzipien.

  • Pertuzumab:

    • Blockiert sterisch eine Bindungstasche

      • essentiell für:

        • Rezeptordimerisierung

        • Signalauslösung

  • (Ado)-Trastuzumab Emtansine:

    • Trastuzumab + Mertansin (Cytotoxin)

      • Bindet an Tubulin

      • inhibiert Polymerisation


Nennen Sie fünf pharmakologische Aspekte, in denen sich moderne Biopharmazeutika von konventionellen niedermolekularen Arzneimitteln unterscheiden und erläutern Sie diese in jeweils max. 2 Sätzen

(Öffentlich)



konventionell

modern

Synthese

chemisch

Biosynthese/Gentechnik

Plasmahalbwertszeit

sehr kurz

Stunden-Wochen

Spezifizität

niedrig

hoch

Wirkung

Enzyminhibitor/Rezeptorligand (Agonist/Antagonist)

vielfältiger

Wirkort

intrazellulär/Zellmembran

Extrazellulär/Zelloberfläche


Insulin:

a) Was ist die physiologische Hauptfunktion von Insulin?

b) Nennen Sie dessen natürlichen Syntheseort

c) Gene Sie die wichtigsten Schritte bei dessen Biosynthese an

d) Aus wie vielen Polypeptidketten besteht Insulin und wie viele Disulfidbindungen trägt es?

  • a) Hauptfunktion: Kontrolle Blutzuckerspiegel (<= 100mg Glucose / 100ml)

  • b) Bauchspeicheldrüse

    • β-Zellen der Langerhans´schen Inseln

  • c) Biosynthese:

    1. Zellkern: DNA

    2. Transkription: -> Enfernung Intron

    3. mRNA -> Präpro-Insulin

    4. wandert in ER und Golgi-Apparat

      • Entfernung Signalssequenz

      • Faltung

      • Schließung der DSB

      • -> Pro-Insulin β-Granula des Golgi-Apparats

        • Entfernung C-Peptid

        • —> Insulin

  • d) 2 Polypeptidketten, 3 DSB


Nach welcher Strategie verläuft die heutige gentechnische Produktion von Humaninsulin in E. coli?


  • Gentechnische Produktion in E.Coli:

    • Seperate Produktion von A- und B-Kette als Fusionsprotein mit verkürzter β-Galactosidase

    • Reinigung

    • BrCN-Spaltung

    • Mischen

    • Oxidation der DSB


Nennen Sie 2 modifizierte Fromen des Insulins. Geben Sie die quasi gegensätzlichen Wirkungen an. Beschreiben Sie in einem Satz, welche biophysikalische Eigenschaft des Insulins dabei ursächlich manipuliert wurde.

  • modifizierte Formen:

    • Insulin Lispro

      • beschleunigte Wirkung

      • Stabilisierung: Insulinmonomer

    • Insulin Glargine

      • verlangsamte Wirkung

      • Stabilisierung:

        • Kristallpackung

        • Hexamerbildung


Nennen Sie die beiden natürlichen immunologischen Effektorfunktionen "nackter" humaner Antikörper.

(23)

  • ADCC – Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity

  • CDC – Complement-Dependent Cytotoxicity


Was versteht man unter dem neuen Konzept ADEPT?

(23)

ADEPT: Antibody-Dependent Enzyme-mediated „Prodrug“ activation Therapy


Beispiel für „Bewaffnung“ von Antikörpern via Enzym-Fusionen

Nennen sie zwei für die Humantherapie zugelassene Antikörper, bei denen der Effektormechanismus keine wesentliche Rolle spielt, und beschreiben Sie deren Wirkmechanismen einschließlich Nennung des Targets jeweils in maximal drei Sätzen.

(23)

  1. Trastuzumab/Herceptin

    • Komplex mit Rezeptor v. HER2

      • -> Störung Dimerisierung

    • Clustering v. HER2 an Plasmamembran

      • -> Endocytose -> lysosomaler Abbau

    • Inhibition HER2 Proteolyse

      • -> Verbleibender Rezeptorteil noch stärkere Aktivität

  2. Pertuzumab

    • Bindet HER2 nahe Zentrum (Subdomäne II)

      • -> blockiert Bindetasche

        • -> Verhindert Heterodimerisierung

        • -> Verhindert Signalauslösung


Welche zwei zentralen biologischen Effekte spielen für die lange Plasma-Halbwertszeit der Antikörper eine Rolle? Nennen Sie jeweils den Mechanismus und die relevante Moleküleigenschaft.

(ancient)

  • Endosomales Recycling

    • Eigenschaft: Fc-Teil

  • Nierenfiltration

    • Eigenschaft: Größe


Nennen Sie drei Typen von therapeutischen Proteinen, die man zunächst "klassisch" aus tierischen oder menschlichen Quellen isoliert hat, für die aber später gentechnische Verfahren entwickelt wurden. Geben Sie jeweils zwei wesentliche Vorteile des rekombinanten gegenüber dem konventionellen Protein an. Beschreiben Sie außerdem jeweils in einem Satz eine gebräuchliche gentechnische Produktionsstrategie unter Angabe des Wirtsorganismus.

(23)

  1. Insulin aus Schweinepankreas

    • Vorteile:

      • humanidentische Sequenz

    • Strategie:

      • Produktion in E.Coli als rekombinantes Fusionsprotein

      • Rückfaltung in vitro

  2. Wachstumshormon aus humanen Hypophysen

    • Vorteile:

      • keine Kontamination mit Erregern

      • Reiner

    • Strategie:

      • Produktion in E.Coli

      • Rückfaltung aus Inclusion Bodies oder

      • Sekretion ins Periplasma -> Extraktion gefaltetes Protein

  3. AK as Pferdeseren

    • Vorteile:

      • monokolonal

      • man kann humanisieren

    • Strategie:

      • Produktion in tierischer CHO-Kultur

      • Isolierung aus dem Medium


Beschreiben Sie drei therapeutische Proteine (Name und molekularer Aufbau des Wirkstoffs), die zur Behandlung pathologischer Neoangionese eingesetzt werden und geben Sie jeweils (grob) das Indikationsgebiet an.


Wie heißt das diesen Substanzen gemeine biomolekulare Target und der zu inhibierende Rezeptor?

  1. Aflibercept - (Eylea)

    • Wirkstoffaufbau:

      • humanes Fusionsprotein

        • 2. Ig-Bindedomäne v. VEGFR-1

        • 3. Ig-Bindedomäme v. VEGFR-2

        • Fc-Region = IgG1

    • Indikationsgebiet: Neovascular Age-related Macular Degeneration (AMD)

  2. Etanercept - (Enbrel)

    • Wirkstoffaufbau:

      • Immunadhäsin

        • dimeres Fusionsprotein

          • extrazelluläre Region v. Membranrezeptor

          • Fc-Teil (+ Hinge-Region) v. Immunoglobulin

    • Indikationsgebiet: Rheumatoide Arthritis (RA)

  3. Bevacizumab - (Avastin)

    • Wirkstoffaufbau:

      • CDR-Grafting -> humanisierung huVEGF Maus-AK

    • Indikationsgebiet: Metastasierender Kolorektalkrebs


—> Gemeinsames Target und Rezeptor:

  • Target: VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)

  • Rezeptor: VEGFR-2


Geben Sie drei typische Wirkmechanismen für moderne Biopharmazeutika an und erläutern Sie diese mit jeweils bis zu drei Sätzen sowie einer Skizze.

  1. Liganden-Antagonist oder Antidot:

    • bindet das Signalmolekül -> Bindung an den Rezeptor verhindert

  1. Rezeptor-Antagonist:

    • bindet selbst an Rezeptor, aber ohne Wirkung

    • Verdängt Agonist

    • kompetitiver -> Agonist kann wieder selbst verdängen

    • nicht-kompetitiv -> irreversible Hemmung

  1. Zelluläres Targeting zur Detektion oder Eliminierung:

    • Gift an Antagonist

    • Bindung -> zerstört Rezeptor


Was versteht man unter "PEGylierung" eines Biopharmazeutikums und welche beiden pharmakologisch relevanten Effekte kann man damit erzielen (max. 3 Sätze)?

PEGylierung:

  • Kovalente Bindung von Poly-ethylen-glykol (PEG) an ein Biopharmazeutikum

Pharmakologisch relevante Effekte:

  • Verlängerte Halbwertszeit durch:

    • Reduzierte renale Ausscheidung (Niere)

    • Schutz vor proteolytischem Abbau

  • Verringerte Immunogenität:

    • Minimierte Erkennung durch das Immunsystem


Nennen Sie drei zugelassene PEGylierte Wirkstoffe sowie deren jeweiliges Anwendungsgebiet.

  • PEG-asparaginase (Oncaspar)

    • Leukämie

  • PEG-interferon alpha-2a (Pegasys)

    • Hepatitis C

  • PEG-uricase (Krystexxa)

    • Chronische Gicht


Welche zwei grundlegende proteinchemische Kopplungsmethoden stehen bei PEGylierung zur Wahl?

Geben Sie die reaktive Gruppe auf Seite des PEG-Reagenz sowie die passende Aminosäure auf der Seite des Proteins an.

  • Lysinkonjugation

    • Reaktive Gruppe PEG-Reagenz: N-Hydroxysuccinimidyl (NHS)-Ester

    • Passende Aminosäure bei Proteins: Lysin (ε-Aminogruppe)

  • Cystein-spezifische PEGylierung

    • Reaktive Gruppe PEG-Reagenz: Maleimid

    • Passende Aminosäure bei Proteins: Cystein (Thiolgruppe)


Nennen Sie zwei Nachteile der PEGylierungstechnologie an, welche derzeit im Rahmen der biopharmazeutischen Produktentwicklung diskutiert werden.

  1. Immunogenität

    • Bildung von Anti-PEG-Antikörpern

    • Mögliche allergische Reaktionen und verringerte Wirksamkeit

  2. Heterogenität und Komplexität

    • Mehrere PEGylierungsstellen -> Produktheterogenität

    • Erschwerte Charakterisierung und Qualitätskontrolle


Was ist eine Kaplan-Meier-Kurve?


  • zeigt Overall Survival (OS)

  • x = Zeit seit Diagnose/Therapiestart

  • y = Überlebensrate (meistens in %)


Was ist stable disease?

weder ab- noch zunehmende Krebserkrankung in Ausmaß oder Schweregrad

Was ist Cure im Vergleich zu Response?

  • Cure:

    • kein neues Tumorwachstum

    • auch nach Absetzen der Therapie (länger)

  • Response:

    • objective: messbares Ansprechen auf Therapie

    • Partial: weniger Tumor aufgrund Therapie


Was ist Serumkrankheit?


  • Serum aus Tieren gewonnen -> Serumkrankheit: Immunreaktion auf Serum


Was ist Arming?

  • direct arming:

    • AK bindet an Tumorzelle

  • indirect arming:

    • AK bindet über Kopplungsprotein

    • z.b. bispezifiescher AK


Was ist Endosomal Recycling?

  • Zellen: FcRn-Rezeptoren

    • Proteine bleiben trotz Endosomen

  • Kann Plasma-Halbwertszeit stark verlängern

  • bei AK, z.b. Immunadhäsin


Was ist Nieren-Filtration?

  • Niere filtert Blut:

    • -> trennt schnell kleine Proteine vom Plasma

    • -> sehr kurze Zirkulation kleiner Proteine/Peptide


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Mista F.

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