Ordnen Sie die Begriffe zu
a) MALDI
1-ddNTP
b) Phred Score
2-Stempelförmig
c) Edman Abbau
3-Cystein
d) Lysin
4-Sinapinsäure
e) EOF
5-Fehler
f)Epitop
6-FWHM
g) Massenauflösung
7-Primer
h)Disulfid
8-e-Aminogruppe
i)PCR
9-Phenylisothiocyanat
j) Sanger
10-Paratop
j
e
h
a
b
g
i
d
c
f
Wofür stehen die folgenden Abkürzungen?
MALDI
NHS
ELISA
PITC
HPLC
MALDI = Matrix assisted laser desorption ionization
NHS = N-Hydroxysuccinimid
ELISA = Enzyme linked immunoabsorbent assay
Phenylisothiocyanat
High perfomance liquid chromatography
Welche der folgenden Aussagen zur Spaltung von Proteinen ist richtig?
Welche der folgenden Aussagen zum Edman-Abbau ist richtig?
Welche der folgenden Aussagen zu Detergenzien ist richtig?
Welche der folgenden Aussagen zu Trennmethoden ist richtig?
Welche der folgenden Aussagen zur Kapillarelektrophorese (CE) ist richtig?
Welche der folgenden Aussagen ist richtig zum Prinzip der MALDI-MS ist richtig?
Welche Aussage zur Verwendung von Antikörpern ist richtig?
Welche Aussage zur Verwendung von Biotin zur Kopplung von Proteinen IN verschieden Assayformen ist richtig?
Sie haben ein Protein identifiziert, welches eine wichtige Rolle im Insulinsignalweg spielt und vor allem bei Diabetikern vorzuliegen schreint. Um Antikörper für Westernblot und ELISA zu generieren, haben Sie ein syntehtisches Peptid ihres Proteins herstellen lassen. Das Peptid hat die Sequenz YYTTTWVMT und eine Masse von 1165,5 Da.
a) Der Hersteller hat das Peptid nach der Synthese mit ESI-MS analysiert und das Massenspektrum zur Qualitätskontrolle mitgeliefert. Leider ist beik Ausdruck ein Großteil der Schrift nur unleserlich gedruckt worden.
Vervollständigen sie das Spektrum mit den m/z Werten und mit den Bezeichnungen der Ionenspezies für alle drei Peaks. Beschriften Sie die Achsen des Massenspektrum.
Welche Masse ergibt sich für die Molekülmasse des Peptids? Was folgern Sie daraus für das synthetische Peptid?
11b) Zusätzlich zum Massenspektrum nehmen Sie ein Fragmentionen-spektrum (MS/MS Spektrum) des Peptids nach Fragmentierung des zweifach-geladenen Molekülions an ihrem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer auf. Erklären Sie die Einstellungen, die Sie dafür an Q1, an Q2 und an Q3 im Triplequadropol benötigen durch Beschriftung der folgenden Zeichnung und kurzen erklärenden Text.
Q1: Dient als Massenfilter, ist auf einen bestimmten m/z Wert eingestellt, sodass nur zweifach-geladene Molekülionen durchegalssen werden
Q2: Kollisonszelle, ausgewähltes Molekülion aus Q1 wird fragmentiert
Q3: Massenanalyse des Fragmentions aus Q2. Ergibt MS/MS Spektrum
11c. Nach Zuordnung von nur einer Aminosäuren zu Peaks im MS/MS-Spektrum stellen Sie fest, dass das gelieferte Peptid nicht die gewünschte Sequenz hat. Wie haben Sie dies festgestellt?
Sequenz YYTTTWVMT
AS Sequenz analysieren bzw. ausschreiben
Abstände klar machen
Am einfachsten größten Peaks analysieren, dann wird man sehen das Abstände nicht passen und dann merken das es eine andere AS Sequenz ist
Erklären Sie die Vorgehensweise bei der quantitativen Aminosäurenanalyse von Proteinen.
Beantworten Sie dabei folgende Fragen:
Für welche Aminosäuren können Sie keine spezifischen Informationen gewinnen?
Welche Aminosäuren sind nur bedingt quantitativ bzw. nach Optimierung der Methode bestimmbar?
Wie kann die Empfindlichkeit der Aminosäurenanalyse beeifnlusst bzw. verbessert werden?
Wie können Sie aus der Menge an Aminosäuren die Menge eines Proteins mit bekannter Aminosäuresequenz berechnen?
Ablauf:
Informationen über AS informieren
Totalhydrolyse in extremen Bedingungen in 6M HCl
Entfernung der O2 Gruppen mithilfe von Scavengern
evtl. Derivatisierung zur Erhöhung der Empfindlichkeit durch FMOC oder OPA
Detektion und Messung mittels HPLC
Keine Informationen für Tryptophan (wird zerstört), Asparagin und Glutamin (werden deaminiert)
Cystein und Methionin (anfällig für Oxidation, müssen vorher optimiert werden)
Serin und Threonin (neigen zur Zersetzung, müssen ebenfalls optimiert werden)
Derivatisierung
sensitive Detektionsmethoden
optimierung chromatographischer Bedingungen
Berechnung der Proteinmenge, indem Summation der molaren Anteile z.B 1nmol AS, 10x mal vorhanden = 0,1 nmol
Sie analysieren ein Peptid mittels Aminosäureanalyse, Endgruppenbestimmung durch Dinitrolfluorbenzol (DNFB) und Carboxypeptidasen, Edman Abbau sowie enzymatischen Abbau mit den Enzymen GluC und Trypsin. Sie stellen folgendes fest:
Aminosäureanalyse ergibt eine Aminosäurezusammensetzung (2xE, 2xH, F, L, N, K, S, Y)
Endgruppenanalyse mit DNFB ergibt: H
Carboxypeptidasespaltung ergibt: L
Abbau mit GluC und Bestimmung der Aminosäurenzusammensetzung der entstandenen Peptide ergibt (E, F, H) und (E, K) und (H, L, N, S, Y)
Abbau mit Trypsin ergibt (E, F, H, K) und (E, H, L, N, S, Y)
Edman Abbau des dritten Peprids des GluC Abbaus (H, L, N, S, Y) ergibt NHS (L,Y)
(In klammern und mit Komma getrennt: Aminosäurenzusammensetzung)
a) Wie ist die Sequenz des Ausgangpeptids?
HFEKENHSYL
13b. Geben Sie die Reaktionsgleichung (mit Strukturen) für Phenylisothiocyanat mit dem Peptid an. Diese Reaktion wird zum Beispiel im ersten Schritt im Edman Abbau verwendet?
Erklären Sie die Vorgehensweise beim Westrn Blot in 5 Schritten, jeweils mit kurzer Erklärung von 1-2 Sätzen. Wie können Sie den Western Blot für sehr kleine Proteine optimieren?
Trennung mit SDS-Page, Trennung nach Molekulargewicht
Blotten der Proteine auf Membran
Blockieren der freien Bindungsstelle auf Membran (damit AK spezifisch binden)
Bindung eines AK an AG (Protein)
AK gekoplelt mit Enzym
Enzym setzt Substrat um > es kommt zu Farbumbschlag, welcher gemessen wird
Waschschritte sind wichtig um eine hohe Spezifität zu garantieren.
Sie haben mittels Sanger Methode die Sequenz einer unbekannten DNA untersucht, doch ist ein großer Teil der Sequenz nur mit hoher Fehlerrate bestimmt worden. Sie wiederholen die Analyse mit einer neu erworbenen NGS-technik, die als IonTorren bekannt ist.
a) Erklären Sie das zugrundeligende Prinzip der IonTorrent Methode zur Sequenzierung von DNA und nennen Sie dabei die Details, die zu einer eindeutigen Basenzuordnung wichtig sind.
beruht auf Konjugation des Nucleotids beim Strangsynthese-Schritt freiwerdender Protonen
gemessen/detektiert wird durch pH-Messung im extrem miniaturistisch gefäß mit Silicium-Chip & miniaturisierte Elektrode
Aufbau: Siliciumplatte mit 4 Wells, wobei jedes Well eine kleine Elektrode besitzt
bis zu 100MegaBP/Stunde
wichtig für eindeutige Zurodnung: nur ein Nukelotid pro Zyklus
15b)Sie haben mittels Sanger Methode die Sequenz einer unbekannten DNA untersucht, doch ist ein großer Teil der Sequenz nur mit hoher Fehlerrate bestimmt worden. Sie wiederholen die Analyse mit einer neu erworbenen NGS-technik, die als IonTorren bekannt ist.
Durch welche Innovation konnte dieses als NGS Technik implementiert werden (3 allgemeine Punkte, 1 speziell für Ion Torrent)?
hohe Parallelisierung
Miniaturisierung
Effizienter: weniger Material/Enzym-Verbrauch
mehrachsequenzierung auch Überlappung kürzerer read lengths möglich
15c) Zur Berechnung von fehlerraten für jede einzelne Base wird der Phred-Score verwendet. Wie ist dieser definiert?
Maßzahl der DNA-Sequenzierung, um Qualität und Zuverlässigkeit einer bestimmten Base innerhalb einer Sequenz anzugeben. Score ist eng mit Fehlerrate verknüpft, gibt an, wie wahrscheinlich eine Base falsh bestimmt wurde.
Hoch = wahrscheinlich wenig Fehler, hohe Zuverlässigkeit
Niedrig = Wahrsceinlich falsch bestimmte base, geringe Zuverlässigkeit
15d) Warum ist die Zurodnung eines individuellen Fehlers für jede sequenzierte Base ein wichtiger Faktor um eine zuverlässige und genaue Sequenzierung von DNA in komplexen Gewebeproben zu erreichen?
Um die Fehlerquelle auszumachen
ist die Probe der Fehler
das Gerät
die Methode
Bei der Verwendung von PCR zur Amplifikation treten oft Fehler auf, die einen korrekten DNA Sequenzierung erschweren.
a) Nennen Sie zwei Ursachen für PCR Fehler, die bei der Sequenzierung der folgenden DNA Sequenz wahrscheinlich sind.
AGTCTCGATACTACCCCCCCCGATCGATCGAGACT
Polymerase Fehler durch repetitive Sequenzen
Hoher GC Gehalt
Falscher Einbau von Nukleotiden
Wie kann durch die sogenannte Bar-coding Methode, ein spontan auftretender Fehler bei der PCR Amplifikation durch Einbau des falschen Nucleotids von real vorliegenden DNA Mutationen unterschieden werden?
An Fragment wird durch Ligasee ein Bar code angehängt
Amplifikation und Sequenzierung der Fragmente
Alle Moleküle mit grüner Sequenz tragen Mutation
Amplifikation und sequenzierung
Es treten fehler auf
Zirkularisierung des Fragments mit Amplifikation
Wenn gelegentliche Abweichung auftritt ist es ein PCR Fehler
Zuletzt geändertvor 4 Monaten