Methoden bei IMGM

• Isolierung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichsten Probenmaterial

• Qualitätsprüfung

• Metagenomics mit 2STep PCR

• qPCRs

• Library Preps zur Sequenzierung an Illumina Platformen

• Probenmanagement

• GCP und GLP, d.h. viel Dokumentation, Proben im 4-Augenprinzip usw.

• DNA/RNA-Absorptionsmessungen: Nanodrop

  • Absorption von Licht bestimmter Wellenlängen

• Fluorometrische Quantifizierung von Nukleinsäuren: die anderen drei

  • Fluoreszenzfarbstoffe die sich in DNA/RNA anlagern und detektiert werden

• Matrix Extraktion ist mit Säulchen

  • Zellen aufbrechen lysieren > Zentrifugieren > abnehmen der wässrigen Lösung > Säulchen mit Silikamemebran > durch Ladung: Bindung > mehrere Waschschritte > Trocknen (Pufferreste) > Eluieren in Wasser (Nukleinsäuren sind wasserlöslich)

• Phasenextraktion mit + Phenol/Chloroform und Zentrifugation -> 3 Phasen aber mit anschließender Säulchebextraktion

  • Nukleinsäuren oben in einer wässrigen Phase darunter Zelltrümmer und Proteine

  
  

• Isolierung von DNA mit dem NukEx Pure RNA/DNA Kit von Gerbion

• DNA-Isolierung mit dem AllPrep DNA/RNA Mini Kit

• RNA Isolierung aus PAXgene Blut

• RNA Isolierung aus PAXgene Knochenmark

• Isolierung von RNA/miRNA aus Exosomen (exoRNeasy Kit)

• Isolierung von Gesamt RNA inkl. miRNA u. kleiner RNA aus Zellen/Gewebe (miRNeasy Mini/Micro Kit)

• RNA Isolierung aus Gewebe/Zellen mit Rneasy Kits

• Isolierung von cfDNA mit dem MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit für KingFisher Flex

• DNA-Isolation aus PAXgene Blood DNA Tubes

• DNA-/RNA-Isolierung aus FFPE (AllPrep Kit)

• RNA Isolierung aus Gewebe mit Rneasy Mini Kit

• RNA Isolierung aus fettreichem Gewebe mit Rneasy Lipid Tissue Mini Kit

kurze RNA Sequenzen

Regulation der Genexpression und damit zellulären Proteinsynthese beteiligt ist

Sie scheint eine Transkription einzelner Gene zu unterdrücken ("silencing")

und damit quasi eine entgegengesetzte Funktion auszuüben wie die mRNA

• nicht codierenden

• Teil des Ribosoms (Ort Proteinsynthese)

• Regionen sind hochkonservierte (unverändert durch Evolution) als auch hypervariable (Artspezifisch)

-        Prokaryoten 16S-RNA (Bakterien)

-        Eukaryoten 18S-RNA (Tiere und Pflanzen)

alle Mikroorganismen (Bakterien, Archaeen, Viren, Pilze) die einen Organismus besiedeln (Tier, Mensch, Pflanze).

alle Genetischen Sequenzen aus diesen Mikroorganismen hat man das Metagenom

sucht man mit Primern die auf 16/18S codierende DNA passt nach allen Mikroorganismen in einer Probe. Da diese Sequenzen Artspezifisch sind, kann man in einer Probe rausfinden, welche Mikroorganismen sie enthalten.

Die erste PCR verwendet einen universellen TS-Primer (Target Spezifisch).

Amplifizierung der Zielsequenz + verlängern universelle Tag-Sequenz

-> An diese können dann in der zweiten PCR die Index-Primer, Indizes und Sequenzier-Adaptoren anhängen

-        farbstoffbasierter qPCR (Dye-based)

-> bei uns SYBR Green

-        sondenbasierter qPCR (Probe-based) -> bei uns Taq-Man

• immer DNA oder cDNA

• immer mit Standardkurve

• I.d.R. 6 bekannter Konzentrationen

• LibQuant, AA-0322

• bakterielle DNA,

  
  

  genspezifischer Sonde	Detektion mit Farbstoff, der unspezifisch an DNA bindet
  bei uns TaqMan	SYBR Green
  Sonde: aus Farbstoff (VIC/FAM/Cy5) und Quencher
  Durch Amplifikation wird Quencher abgespalten und Farbstoff fluoresziert	Ungenauer aber günstiger

• bei uns immer Genexpressionsanalysen

• auch mit TaqMan oder SYBR Green

• aber ohne Standardkurve

• welche Gene sind in einer Probe aktiv. Im Vergleich zu einer anderen Probe

• behandelt/unbehandelt

• Spezifische Primer

• Single Nucleotid Polymorphism

• Mutation in einem einzigen Basenpaar

• 2 der Proben(Allele) verglichen eins ohne Mutation eines mit vermutlicher Mutation

• 2 Taq-Man Sonden Zielgenspezifisch:

  1x für das SNP

  1x Gensequenz ohne Mutation

• Hersteller für spezifische Sonden:

  “SNP Assay Library“ beim Hersteller runter laden

• Positivkontrollen: Homozygot für Allel 1 oder Allel 2 oder heterozygot angeben

• KASP ist nur eine Chemie für SNP qPCRs

DNA

• NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit

• AmpliSeq DNA Library (für ganz bestimmte custom designed DNA Zielregionen)

RNA

• NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit (mRNA zunächst extrahiert, geht über Poly A Schwänze)

• teilweiße mit NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit (ribosomale RNA ist nicht immer von Interesse generiert aber i.d.R. die meisten Reads,wird diese rausgereinigt, mit Köder-DNA-Oligos)

• NEBNext small RNA Library Prep Kit, mit Gelaufreingung (Gel ohne Farbstoff, wird nach dem Lauf gefärbt). Spezieller Ladder, Bande bei 147bp

• Illumina TruSeq RNA Exome Library (mit geringer Qualität, wie FFPE, sehr aufwändig, mehrere Tage,sehr lange PCRs)

• enzymatische Fragmentierung

• EndRepair und dA-Tailing (A-Überhang am 3‘Ende) als Vorbereitung auf die Adapter Liagtion

• Adapter Ligation

• AmpureXP Beads, zur Größenselektion (aber auch Entfernung von Sequenzieradaptern, PCR-Primern, dNTP, Enzymen und Pufferverunreinigungen)

• PCR Ampflifiziert und die Indices angehängt und nochmal aufgrereinigt

Zusammengefasst:

DNA wird so vorbereitet, dass sie Sequenzierbar wird. Dazu werden Illumina Adapter (passend zu Primern Flowcell) angebaut. Dann kommen noch Indizes dazu um Sequenzierung im Pool zu ermöglichen. Mit meherern Aufreinigungsschritten werden Größenselektion aber auch Entfernung von Sequenzieradaptern, PCR-Primern, dNTP, Enzymen und Pufferverunreinigungen ermöglicht. Es gibt dann noch ein Pooling und eine QC um Cluster optimal auszunutzen.

• Flusszelle mit Primern

• Adaptoren binden

  • durch 3’ und 5’ Primer auf der Flowcell gehen die Fragmente eine Brücke ein. Weil an zwei Seiten auf Platte gebunden

• Durch PCR, entstehen neue Stränge.

• Diese Binden wieder an neue immibilisierte Primer in der Nachbarschaft dadurch entsteht ein Cluster

• Alle Sequenzen eines Clusters liefern das gleiche Signal, dadurch wird die Sequenz genauer

-        QM Handbuch

-        Organigramm

-        Formblätter, Arbeitsanweißungen (festes Vorgehen), Verfahrens und Geräteanweißungen

-        Umgang mit fehlerhaften Arbeiten

(Good Laboratory Practice) + (Good Clinical Practice)

• zertifiziert

Studien mit Zellen und Tierversuchen, Klinische Studien am Mensch

• registrieren im 4-Augenprinzip

• Ausfüllen von Probenempfängen

• Biobanking haben

• SOPs geben

• Abweichungen angegenen werden

• alles dokumentiert und unterschrieben werden

• Schmierzettel müssen gelenkte FB sein

• regelmäßige Audits