Altklausur ab WS 18 2.

-> AG- Capture ELISA

• es werden enzymgekoppelte AK auf der Platte fixiert.

• Dann wird mit AG inkubiert.

• ANschließend gewaschen

• Detektion erfolgt ebenfalls über Farbreaktion /opt. Dichte durch vgl. mit Standard

  -> wird gemacht, wenn es nur möglich ist, einen einzigen AK gegen das AG zu generieren oder das AG sich nicht auf einer Mikrotiterplatte immobilisieren lässt.

Hydrolyse von Phosphorsäureestern -> Phosphorsäure

• Basensequenz von Fomivirsen ist zu dem Ausschnitt der MRNA komplementär -> spezifische Bindung in dem Bereich -> Blockierung der Proteinbiosynthese

• Blockierung der Proteinbiosynthese -> verhindert Vermehrung des Virus

• Skizze:

• UDP- Glucose- Pyrophosphorylase und Glykogen- Phosphorylase katalysierten phosphorylytische Spaltung unter Phosphatverwendung und H2O- Entstehung.

• Phosohatasen katalysieren Phosphatgruppenabspaltung.

-> Isomerase, 8. Schritt der Glykolyse

= Vorgang, bei dem ein Protein nach vollständiger Translation durch kovalente Addition eines Moleküls verändert wird.

• oft reversibel und enzymkatalysiert

• Hauptklasse: Hydrolase

• Lysozym ist Teil des angeborenen Immunsystems und in Tränenflüssigkeit, SPeichel und anderen Sekreten zu finden. Auch in Zellen

• es spaltet durch Hydrolyse die glykosidischen beta(1,4)- Bindungen zwischen N-Acetylglucosamin und N- Acetylmuraminsäure

• beide sind Teil der Mureinschicht der Bakterienzellwand

Im Praktikum:

• wurde das Lysozym isoliert (Säulenchrom.) und gelelektrophoretisch aufgetrennt (SDS-PAGE) -> Reinheit!!!

• mit dem isolierten Lysozym wurde ein Aktivitätstest durchgeführt (mit Bakteriensuspension) und die optische Dichte vermessen.

• Konzentrationsbestimmung über Bradford-Test mit Coomassie-Blau-Färbung und anschließendem Abgleich mit Standard

Alternativ: (zur Konz. Bestimmung nach Bradford)

• Lowry (Molybdänblau- Reaktion)

• Biuret (Peptid-Ca2+-Komplex)

• Reduktion von SIlber

• ELISA, ASA, BCA

• F26bP und AMP -> Stimulierung

• Citrat und ATP -> Inhibition

• Denaturierung:

  • 95°C

  • Trennung der DNA- Doppelstränge

• Annealing:

  • Abkühlung auf Temperatur passend zum verwendeten Primer

  • ca. 60°C

  -> Primer lagern sich an komplementäre DNA- Sequenz

• Elongation:

  • 70-72°C

  • Verlängerung der Sequenz mit Nukleotiden durch Taq- Polymerase

  • Temp.- erhöhung um unspezifische Bindung des Primers zu verhindern

  • DNA- Stränge lagern sich nicht mehr zusammen, da Primer gebunden sind

• erneuter Zyklus

  • bis 25-30 Zyklen

GPI- verankerte Proteine:

• initial werden GPI- verankerte Proteine (z.B. Acetylcholinesterase) mit einem Transmembransegment am endoplasmatischen Reticulum synthetisiert.

• sekundär wird ein glykolysierter Phosphatidylinositolrest unter Kappung des Transmembransegments kovalent an den neuen Carboxyterminus angefügt.

• Als Prototyp ist hier der GPI- Anker von Thy-1 stark vergrößert (in Realtion zur Membran) dargestellt.

-> Vermutlich erhöht der Wechsel von der Transmembran- zur GPI- Verankerung die laterale Mobilität der Proteine in der Membran; gleichzeitig macht es sie für Phospholipasen (=> Signaltransduktion) empfänglich.

=> ist ein Harnstoffstabilitätstest.

• bei dem die Aktivität von LDH- Isoenzymen in An- und Abwesenheit von Harnstoff gemessen wird.

• M4 wird von Harnstoff inhibiert.

ATP = Adenosintriphosphat

• Malonyl- CoA wird gebraucht, um bei der Reaktion mit Acetyl-CE irreversibel zu reagieren.

  • weil CO2 abgeht und da gasförmig, der Rückreaktion sofort entzogen wird.

• Die RNA- Polymerase liest in 3´zu 5´Richtung ab

• und schreibt in 5´zu 3´Richtung

• Hydrolyse = Abspaltung der FS von Phospholipiden (Triacylglyceriden)

Pyruvat- Dehydrogenase:

• beteiligt an der oxidativen Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA

• ist ein Multienzymkomplex aus 3 Enzymen und 5 Coenzymen

E1 = Pyruvat- Dehydrogenase

• Thiaminpyrophosphat (enzymgebunden)

  -> Vit. B1

  -> Decarbox. Pyruvat

  -> an Energieproduktion beteiligt

  -> als Antioxidans

E2 = Dihydroliponamid- Acetyltransferase

• Liponsäure (enzymgebunden)

  -> 2x S wird zu SH reduziert

• Coenzym A (löslich)

  -> Transfer Acetylrest auf CoA

  -> Schlüsselmolekül

E3 = Dihydroliponamid- Dehydrogenase

• FAD (enzymgebunden)

  -> elektronenaufnahme aus Reduktion

  -> überträgt diese auf NAD+

• NAD+ (löslich)

  -> nimmt e- auf und ermöglicht damit Regeneration von Liponamid

  -> Redoxreaktion

• 1) Hydroxylierung von Lysin und Prolin im Kollagen

• 2) Acetylierung von Lysin bei Histonen zur Neutralisierung der positiven Ladung, um weniger mit negativen Ladungen der DNA zu interagieren.

• 3) Phosphorylierung von Serin und Threonin oder Tyrosinresten spielt eine große Rolle in der zellulären Signaltransuktion.

• Heterotetramer auf 2 alpha- und beta- UE, die durch Disulfidbrücken kovalent gebunden sind.

• je alpha- UE kann ein Insulinmolekül binden.

• Bindung führt zur Konformationsänderung, wodurch Tyrosinreste der beta- UE phosphoryliert werden.

• dadurch würd über ein intrazellulär gelegenes Signaltransduktionsprotein eine Kaskade aktiviert, die letztenendes die Glykogen- Synthase aktiviert, um Glucose über Glykogenbildung zu entfernen.

aus a) vmax = 2

• 1/4 von vmax = 0,5. Reziproke Auftragung, also 1/0,5 = 2

• von dem Wert 2 der y- Achse bis zur Geraden rüberzeihen und am Schnittpunkt den x- Wert ablesen!

  -> dort ist 1/Km hier 0,75

• 1/0,75 (3/4) = 4/3, = 1,33mMol

• Km = Michaelis- Menten- Konstante

  • gibt die Substratkonzentration an, die bei Halbmaximaler Reaktionsgeschwindigkeit vorherrscht.

  • sie beschreibt die Affinität eines Enzyms zu seinem Substrat.

  -> Je größer der Wert, desto geringer die Affinität.

• Kcat = vmax/[Eo] = Wechselzahl

  • je größer Kcat, desto höher die Produktbildung

  • Wie viele Substratmoleküle werden bei Sättigung des Enzyms pro Zeiteinheit umgesetzt?

• Kcat/Km = Maß für die katalytische Effizienz

  • dient dazu die Leistungsfähigkeit eines Enzyms zu beurteilen.

  • wird genutzt, weil hohe Affinität nicht- gleich hoher Umsatzrate entspricht! Und man die Trägheit des Enzyms ggü. den Substrat mit seiner Umsatzrate standardisiert.

• kompetetive Hemmung = vmax bleibt gleich, Km nimmt zu

  • Reversible Hemmung

  • Inhibitor und Substrat haben ähnliche Struktur => konkurrieren um das aktive Zentrum

    
    

    -> Reversible Hemmung: Die Hemmung kann durch Ablösen des Inhibitors wieder rückgängig gemacht werden.

    -> Kompetitive Hemmung: Ein Substrat und ein Inhibitor konkurrieren aufgrund struktureller Ähnlichkeit um dieselbe Bindestelle (aktives Zentrum) eines Enzyms

• je kleiner das Km, umso höher ist die Affinität zum Substrat!

• Temperatur

• pH

• Konzentration von Substraten und Cosubstraten

• Messtechnik

-> beides primäre Diabetesformen

Typ I:

• beta- Zellen des Pankreas aufgrund Autoimmun- Erkrankung zerstört. Dadurch reduzierte Bildung des Insulins.

  -> symptomatisch hoher Blutglucosespiegel -> Unterversorgung von Fett- und Muskelzellen mit Glucose -> Umstellung des Stoffwechsels (in der Regel Hyperlipämie sowie Ketoacidose).

Typ II:

• “Altersdiabetes”, Ursachen noch nicht hinreichend bekannt. Kein Insulinmangel, sondern reduzierte Insulinwirkung z.B. durch Mangel an Insulinrezeptoren.

• Risikofaktoren: körperliche Inaktivität, Adipositas oder Fettstoffwechselstörungen.

• Im Gegensatz zur Typ 1 Diabetes ist die auftretende Hyperglykämie ein schleichend verlaufender Prozess und somit nicht immer sofort erkennbar.

->Grb2- Adapter: Bindung mit SH3-Domäne an zB SOS (Austauschfaktor) [weiteres Protein]

• Carboxylierung oder Carboxylgruppentransfer zwischen Substraten.

  • zB.: Pyruvat zu Oxalacetat (Gluconeogenese) in Pyruvatcarboxylase

  • oder Acetyl-CoA- Carboxylase (FS-Synthese)

  • oder Propionyl-CoA- Carboxylase (AS-/FS-Abbau)

  • oder Methylcrotonyl-CoA- Carboxylase (Leucin-Abbau)

• N1 von Biotin wird unter ATP- Verbrauch mit Carboxygruppe (zB aus Bicarbonat) verbunden

• aktivierte Carboxylgruppe wird übertragen.

-> Tyrosinkinase- Rezeptor ->phosphorylierung von Tyrosinresten des dimerisierten Rezeptors -> Aktivierung der Rezeptoren -> Rekrutierung Adapter (Proteine)