Agrobacterium tumefaciens

• Boden-Phytopathogen

• natürliche Weise pflanzenwunden infiziert un dide Kronengallen-krankheit verursacht

• dabei bakterielles Typ-IV-Sekretionssytem (T4SS) üertragene (T)-DNA aus der Bakterienzelle in Wirtspflanzenzellen einschleust

• beliebt Pflanzentransformation

Jedes beliebige Gen kann nun einfach verwendet werden, um die Onkogene im T DNA-Bereich verschiedener Arten von binären Vektoren zu ersetzen und so eine genetische Transformation von Pflanzen mit A. tumefaciens durchzuführen

• lässt sich leicht mit A. tumefaciens transformieren

• stabile und schnelle Transformation bei mehreren getesteten Ökotypen zu erreichen

• Transformationseffizienz bei verschiedenen Akzessionen unterschiedlich

• trägt tumorinduzierende (Ti) Plasmid -> induziert Gallen an Wurzel/ Kronen an zahlreichen dikotyler Angiospermenarten/einiger Gymnospermen

• trägt Wurzelinduzierende (Ri) Plasmid -> induziert abnorme Wurzelproduktion

• neoplastische, tumorähnliche Zellwachstum wird durch die Expression von Onkogenen ausgelöst, die sich in der von diesen Bakterien in den Pflanzenkern transportierten und in das Pflanzengenom integrierten Transfer-DNA (T-DNA) befinden

Zwei genetische Komponenten -> lokalisiert bakteriellen Ti-Plasmid

1) T-DNA (Grenzsequenzen: konservierte unvollkommene Wiederholungen von 25 Basenpaaren an den Enden der T Region)

2) Virulenzregion (vir) (mindestens sieben Hauptloci (virA, virB, virC, virD, virE, virF und virG) besteht, die für Komponenten der bakteriellen Proteinmaschinerie kodieren, die die Verarbeitung und den Transfer der T-DNA vermittelt)

1) VirA/G: Zweikomponenten-Regulatoren, die die Expression anderer Vir Gene auf dem Ti-Plasmid aktivieren

2)VirB/C/D/E/(F): Verarbeitung, dem Transfer und der Integration der T-DNA aus A. tumefaciens in eine Pflanzenzelle beteiligt

• Identifizierung mehrerer chromosomaler Virulenzgene (chv), chvA, chvB und pscA, die für die Anheftungsprozesse erforderlich

• chvA/B, pscA: Synthese, Verarbeitung und dem Export von zyklischem β-1,2-Glucan und anderen Zuckern beteiligt

• Während der Anheftung synthetisieren die Zellen von A. tumefaciens Zellulosefibrillen, die eine große Anzahl von Bakterien an den verletzten Stellen einschließen

• Neben der Zellulose und dem zyklischen β-1,2-Glucan produziert A. tumefa- ciens ein weiteres Exopolysaccharid, das unipolare Polysaccharid (UPP), das an der bakteriellen Anheftung beteiligt ist

• unipolare Polysaccharid

• hilft den Zellen von A. tumefaciens, sich auf polare Weise an die Pflanzenoberfläche anzuheften -> Zellpol produziert

• selten planktonischen A. tumefaciens-Zellen oder in Kolonien auf festen Medien beobachtet -> dauerhafte Anheftung genutzt

• zwei Arten von zucker: N-Acetylglucosamin und N-Acetylgalactosamin

• wichtige Rolle bei der bakteriellen Anheftung spielt

(1) Anheftung von A. tumefaciens an die Pflanzenzellen. (2) Erkennung von Pflanzensignalen durch A. tumefaciens und Regulierung von Virulenzgenen in den Bakterien nach der Weiterleitung der erkannten Signale. (3) Erzeugung und Transport von T-DNA und Virulenzproteinen aus den Bakterienzellen in Pflanzenzellen. (4) Nukleärer Import von T-DNA und Effektorproteinen in die Pflanzenzellen. (5) Integration und Expression der T-DNA in das Pflanzengenom

• Vitronectin-Proteinfamilie -> Pflanzenproteine, die immunologisch mit dem tierischen Substratadhäsionsmolekül Vitronectin verwandt sind, wurden unter der Bezeichnung PVN1 (plant vitronectin-like protein 1) in Tabak identifiziert

• Zellwand lokalisiert

• Zelladhäsion vermitteln

• Rezeptor Agrobacterium?

Breite Palette Chemischer Verbindungen -> chemotaktisch Mittel

• Pflanzensaft charakterisitich saueren pH-Wert (5-5.8), hohen Gehalt phenolischen Verbindungen ( Lignin, Flavonoidvorstufen)

  -> Abwehr mikrobieller Angriffe = stimulieren die Expression von A. tumefaciens Virulenzgenen

• Bsp.Vir-Gen-Induktoren: monozyklische Phenole wie 3,5-Dimethoxyacetophenon (Acetosyringon, AS)

• Optimale Umweltbedingungen: Säure, wenig Phosphat, Temperatur und Zucker -> phenole einzige erforderliche

VirA/VirG-Zweikomponenten Regulationssystem

• Signalweg zu initiieren, interagieren pflanzliche Phenole entweder direkt oder indirekt mit dem transmembranen sensorischen Protein VirA -> VirA: Aktivierung des vir-Gens erforderlichen phenolischen Verbindungen direkt wahrnimmt

• nicht VirA, in der Lage sind, das phenolische Signal in vitro zu binden

• ChvE, ein chromosomal kodiertes Glukose/Galaktose bindendes Protein, interagiert mit VirA und verstärkt die Vir Genaktivierung durch Bindung an Zucker

• A. tumefaciens nutzt das ChvE-Protein auch, um verschiedene pflanzliche Zucker zu erkennen und zu binden

• Affinität des ChvE-Proteins für Zuckersäuren bei niedrigem pH-Wert erhöht, was auf eine Verbindung zwischen der Reaktion auf Zucker und Säure in A. tumefaciens hinweist

Transkription von virG zu aktivieren und die Expression mehrerer anderer bakterieller Gene zu induzieren

• Gene, die an Chemotaxis und Motilität beteiligt sind, mehrere chromosomal kodierte Virulenzgene, Succinoglykan-Biosynthesegene und der Gencluster, der für das Typ-VI-Sekretionssystem (T6SS) kodiert

1) ExoR als periplasmatischer negativer Regulator identifiziert (Stromaufwärts der ChvG-Sensorkinase wirkt, um säureinduzierte Genexpression zu unterdrücken)

2)T6SS bei der interbakteriellen Konkurrenzaktivität während des Kolonisierungsprozesses der Pflanze

->säureinduzierbaren Gene eine Rolle für das Überleben und die Konkurrenzfähigkeit von A. tumefa- ciens während der Interaktion zwischen Agrobacterium und Pflanze spielen könnten

Cytochrom P450 ähnliche Enzyme wie VirH2 zur Entgiftung eines phenolischen Vir-Gen-Induktors, der Ferulasäure

• 2 Hydroxy-4,7-dimethoxybenzoxazin-3-on (HDMBOA):angeborene Immunität und verhindert eine erfolgreiche Infektion von Maispflanzen mit A. tumefaciens

• o-Imidochinon-Zersetzungsinterme- diat, (3Z)-2,2-Dihydroxy-N-(4-methoxy-6-oxocyclohexa-2,4-die- nyliden)acetamid :Inhibitor der Signalwahrnehmung in A. tumefaciens

Auxin /Cytokinin: tumorwachstum beitragen,agrobakterielle Physiologie und Genexpression beeinflussen

IAA ->T-DNA-Integration überproduziert : bakterielle Wachstum beeinflusst und die Vir-Geninduktion hemmt, indem es mit phenolischen Induktoren um die Interaktion mit dem VirA-Protein konkurriert

—> niedriger Auxin =Infektion mit A. tumefaciens fördern

Aktivität des Vir-Promotors /bakterielle Wachstum reguliert

Pflanzenabwehrmolekül

Infektionsprozess von A. tumefaciens beeinflusst, indem es die Expression von Vir Genen, das Bakterienwachstum, die bakterielle Anheftung an Pflanzenzellen und die Virulenz hemmt

Expression von vir-Genen in A. tumefaciens unterdrücken, zeigt jedoch keine signifikanten hemmenden Auswirkungen auf das Bakterienwachstum und die Populationsgröße

Produktion einer einzelsträngigen T-DNA (T-strang) -> wirtszelle transportiert

VirD1/2: orts-/ Strangspezifische Endouklease (T-DNA_Rändern aufgerollte Ti-Plasmid)

interagiert nicht nur mit dem VirD2-gebundenen T-Strang, sondern auch mit drei Komponenten des Typ-IV Sekretionssystems (T4SS), VirD4, VirB4 und VirB11, über zwei unabhängige Bindungsdomänen

VBP kann im Zytoplasma von A. tumefaciens ein Dimer bilden und den an VirD2 gebundenen T-Strang durch Interaktionen mit den VirD4-Proteinen an den T4SS-Apparat rekrutieren

vom Virus kodierte T4SS ->vom Virus kodierte T4SS

12 Proteinen (VirB1-B11 und VirD4), die zwei funktionelle Komponenten bilden: einen filamentösen T-Pilus und einen membranassoziierten Transporterkomplex, der für die Translokation von Substraten durch beide bakteriellen Zellmembranen verantwortlich ist

Transportkomplex kann weiter in vier funktionelle Untereinheiten unterteilt werden: das VirD4-Kopplungsprotein als Innenmembran-Translokase Außenmembran-Kernkomplex Substratrezeptor, (VirB3-B4-B6-B8-B11), (VirB7-B9-B10) und eine ein ein extrazellulärer T-Pilus (VirB2-B5)

integrales inneres Membranprotein mit ATPase-Aktivität, das als Kopplungsprotein für die Präsentation von DNA- und Proteinsubstraten an den VirB Transporter verantwortlich ist

DNA-Substraten an das VirD4-Protein und die Übergabe an VirB11 die ATP Hydrolyseaktivitäten von VirD4 und VirB11 aktivieren -> Konformationsänderung von VirB10 bewirken, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung des DNA Substrattransfers durch die Öffnung und den Aufbau des T4SS Apparats spielt

ATPase und enthält ein für die Virulenz wesentliches Walker-A-Nukleotid-Tri-Phosphat-Bindungsmotiv

T-Pilus-Biogenese beteiligt

kann mit dem T-Pilin VirB2 interagieren und über einen ATP-abhängigen Mechanismus Veränderungen im topologischen Zustand der VirB2-Membran hervorrufen

kann VirB11 zusammen mit VirB4 eine strukturelle Veränderung des VirB2-Pilinproteins koordinieren und die Bindung von VirB2 an andere T4SS Komponenten vermitteln, was wiederum die Piluspolymerisation beeinflusst

R388 T4SS kodiert wird, in dem VirB3, VirB4 und wahrscheinlich VirB5, VirB6 und VirB8 Teil des Innenmembrankomplexes

vorhergesagten Innenmembran-Translocase-Komplex überein, der aus VirB3, VirB4, VirB6, VirB8 und VirB11

Außenmembrankomplex

VirB7-, VirB9- und VirB10 Proteinen, die von pKM101 kodiert wurden

14 Kopien von VirB7, VirB9 und VirB10 und ist sowohl in die innere als auch die äußere Membran eingebaut

zylindrisch und enthält zwei Schichten, die innere (I) und die äußere (O) Schicht

Wenn die ATP-Energieverwendung durch die ATPasen VirD4 und VirB11 erkannt wird, ändert sich die Konformität des Proteins VirB10 und kann dazu beitragen, die Öffnung der O-Schicht zu regulieren

kleines Hitzeschockprotein vom Alpha-Kristallin-Typ

• Stabilität mehrerer VirB-Proteine, den effizienten T-DNA Transfer und die Tumorentstehung ist

• Expression von HspL wird durch AS als Reaktion auf die Expression von VirB-Proteinen induziert und fungiert als VirB8 Chaperon

großen Untereinheit VirB2 und der kleinen Untereinheit VirB5 (Pilusspitze)

• jedes virB-Gen für die T-Pilus Biogenese erforderlich ist; allerdings ist nur das virB2-Gen für die VirB2-Pro-Pilin-Verarbeitung und Peptidzyklisierung erforderlich

• Nicht-polare VirB-Mutanten heben den T-Pilin-Transport und die T-Pilus-Biogenese auf und unterstützen ein Modell, in dem der VirB-spezifische Transporter nicht nur für die Verlagerung des T-Komplexes, sondern auch für den Export von zyklischen T-Pilin-Untereinheiten an die bakterielle Zelloberfläche verwendet wird, vielleicht als Gerüst, um den effizienten Aufbau des T-Pilus zu erleichtern

• Aminosäuresubstitutionen in den T4SS-Komponenten VirB6, VirB9, VirB10 und VirB11 die Polymerisation von VirB2-Pilin zur Bildung des extrazellulären T-Pilus blockieren

• VirB5 als mi nor-Komponente in Piluspräparaten und trägt zum Zusammenbau von T-Pilus bei -> Spitzen der zellgebundenen T-Pili -> kontakt wirt bakterien beteiligt

• außerhalb der T DNA-Region und wird während der Infektion nicht in das Genom der Wirtspflanze eingebaut

• Verlust der Expression des Tzs-Proteins und der Sekretion von trans-Zeatin durch die tzs Mutanten korreliert mit einer verminderten stabilen und transienten Transformationseffizienz bei Arabidopsis-Wurzeln, was darauf hindeutet, dass Tzs durch die Synthese von trans Zeatin in einem frühen Stadium des Infektionsprozesses die Effizienz der Pflanzentransformation durch A. tume- faciens moduliert

• Tzs extrazellulär wirken, wahrscheinlich an der Schnittstelle der Interaktion zwischen Agrobacterium und Pflanze

partielle Sequenzähnlichkeit mit dem tierischen Integrinrezeptor aufweist, nachweislich das Kontinuum zwischen Zellwand, Plasmamembran und Zytoskelett in A. thaliana-Zellen vermittelt und für die Anheftung von A. tumefaciens an Pflanzenwurzeln entscheidend ist

heftet sich an das 5'-Ende des T-Strangs und dient als Pilotprotein, um die T-DNA aus den Bakterien in die Pflanzenzelle zu leiten /mehrere Virulenz-Effektorproteine unabhängig voneinander und von der T-DNA aus den Bakterienzellen exportiert werden

fungieren als Sekretionssignal für den A. tumefaciens Transferapparat

filamentöse Struktur in Abwesenheit von T-DNA bildet

VirE2 über Clathrin vermittelte Endozytose in Pflanzenzellen transportiert wird

über ein ER/Actin-Netzwerk, das von Myosin XI-K angetrieben wird, befördert wird

pflanzenaktive Kernlokalisierungssignal-Sequenzen (NLS), von denen man annimmt, dass sie am T-DNA-Import in den Zellkern beteiligt sind.

Wirtzelle nutzen Kernimportsysteme

Pflanzliche Zytoskelett ->beim zytoplasmatischen Transport des T Komplexes spielen

• letzte Schritt des durch Agrobacterium vermittelten Transformationsprozesses

• Gegensatz zu anderen mobilen DNA-Elementen wie Transposons und Retroviren kodiert die T DNA keine für die Integration erforderlichen enzymatischen Aktivitäten ->der Einbau der T-DNA in die Pflanzen DNA durch Proteine, die von A. tumefaciens selbst transportiert werden, nämlich VirD2 und VirE2, und/oder durch Wirtszellfaktoren vermittelt werden

Zuverlässigkeit als auch Effizienz sicherstellt

Die Integration des 5'-Endes des T-Strangs in die Pflanzen-DNA erfolgt im Allgemeinen präzise. Dies könnte auf die Bindung von VirD2 an das 5'-Ende des T-Strangs zurückzuführen sein, die einen Schutz vor Exonukleasen innerhalb der Pflanzenzellen bietet

• Region im C-terminalen Teil von VirD2, die so genannte ω-Domäne, ist am Integrationsprozess beteiligt

• VirD2 am Schutz der Unversehrtheit des rechten Rands ->VirE2 in ähnlicher Weise das linke Ende der T-DNA schütz

VirC2 zur korrekten Verarbeitung beiträg

für die Single-Copy-Integration in diesem System erforderlich ist

zahlreiche zweikeimblättrige

einige einkeimblättrige Angiospermenarten/Gymnospermen

Nicht-Pflanzenorganismen:Pilze, Algen, Seeigel-Embryonen, menschliche Zellen und das grampositive Bakterium Streptomyces lividans

Sie ist einfach anzuwenden, relativ kostengünstig und führt im Allgemeinen zu einer niedrigen Kopienzahl und gut definierten DNA-Insertionen in das Chromosom der Wirtszelle

Aufgrund dieser Einschränkungen und Nachteile der p hysikal ischen und chemischen Transformationsmethoden ist die durch A. tumefaciens vermittelte Gentransfermethode immer noch die am häufigsten verwendete und beliebteste Methode zur Erzeugung transgener Pflanzen und gentechnisch veränderter Nutzpflanzen

Protoplastentransformation durch Elektroporation, Mikroinjektion oder Polyethylenglykol Fusion sind für die Erzeugung transgener Pflanzen weniger gut geeignet, da die Regeneration von Pflanzen aus Protoplasten zeitaufwändig und wenig effizient ist

Mikroprojektil-Beschuss: Sphärische Gold- oder Wolframpartikel werden mit DNA beschichtet und mit einer Partikelkanone auf hohe Geschwindigkeit beschleunigt, so dass sie in das Pflanzengewebe eindringen

Vorrteil: DNA in verschiedene Pflanzengewebe einer Vielzahl von Pflanzenarten eingebracht werden. Das betreffende Gen muss nicht in einen speziellen Transformationsvektor geklont werden, um in Pflanzenzellen transformiert zu werden

Nachteil: führt jedoch in der Regel zu Mehrfachkopien der DNA und zum Verlust der molekularen Integrität der DNA, und es bestehen Beschränkungen hinsichtlich der Größe der DNA. Die komplexen DNA Integrationsmuster führen in der Regel zu genetischer Instabilität und/oder zum epigenetischen Silencing des Transgens in den transgenen Pflanzen

T-DNA-Integration in das Wirtsgenom nicht erforderlich, und die T-DNA-Expression dauert in der Regel einige Tage

Vorteile, als sie es ermöglicht, die Ergebnisse experimenteller Behandlungen innerhalb eines kurzen Zeitraums zu beobachten

langwieriger Prozess, der häufig etablierte Gewebekulturtechniken erfordert, um das Wachstum ganzer Pflanzen aus den transformierten Zellen oder Geweben zu fördern. Für eine stabile Transformation muss die T-DNA in das Genom der Wirtszelle integriert werden, damit sie anschließend an die nächste Generation weitergegeben wird

Onkogene der Wildtyp-T-DNA entfernt, um die Pathogenität des Bakteriums zu beseitigen

gewünschte Gen und die Selektionsmarker für transgene Pflanzen in die T-DNA eingebracht werden

für die DNA-Klonierung in vitro werden molekularbiologische Werkzeuge benötigt.

Ti-Plasmid ist groß und hat in der Regel eine niedrige Kopienzahl -> herrausforderung

Lösung: binäres Vektorsystem, bei dem sich die T-DNA-Region auf einem Replikon mit breitem Wirtsspektrum befindet und die für den T-DNA-Transfer erforderlichen Vir-Gene auf dem entschärften Ti-Plasmid

1)die T-DNA-Wiederholungssequenzen am rechten und linken Rand, die die T-DNA-Region definieren;

2)selektierbare Markergene, die in Bakterien (E. coli und A. tumefaciens) und in Pflanzen funktionieren;

3)Restriktionsendo- nuklease-Stellen innerhalb der T-DNA, um die Insertion eines oder mehrerer interessanter Gene zu ermöglichen;

4)Replikationsursprung(e), um die Replikation von Plasmiden in Bakterien zu ermöglichen

Verschiedene Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene wurden in die T-DNA Region der binären Vektoren eingefügt und für die Selektion transgener Pflanzen verwendet.

Häufigsten: Neomycin Phosphotransferase (NPTII)-Gen für Kanamycin-Resistenz und das Hygromycin-Phosphotransferase (HPT)-Gen, das eine Resistenz gegen Hygromycin verleiht

andere Antibiotika, einschließlich Chlorampheni- col, Gentamicin, Streptomycin, Bleomycin, Blasticidin; Herbizide, einschließlich Phosphinothricin, Gluphosinat, Glyphosat, Bromoxynil; oder Stoffwechselmarker, einschließlich Acetolactat-Synthase, Threonin-Dehydratase, Phosphomannose-Isomerase

häufig verwendeten Reportergenprodukte wie ß-D-Glucuron- idase (GUS), Glühwürmchen- und bakterielle Luziferasen (LUC), grün fluoreszierendes fluoreszierende Proteine (GFP) und andere proteine können in transformierten Pflanzengeweben nachgewiesen werden

transformierten Pflanzengeweben kann durch die Blaufärbung nach Hydrolyse der 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D Glucuronsäure beobachtet oder durch eine fluorometrische Analyse, die die Hydrolyse des 4-Methylumbelliferyl-ß-D Glucuro- nids erfordert, quantitativ bestimmt werden

nützlicher In-vivo-Marker zur Untersuchung der Genexpression oder der Lokalisierung rekombinanter Proteine, da es entweder mit ultraviolettem oder blauem Licht ohne Zugabe von Substraten oder Cofaktoren angeregt werden kann.

häufigsten Wildisolate C58/ Ach5

AGL1, EHA101, EHA105 und GV3101(pMP90) haben den chromosomalen Nopalin-Typ C58 und die modifizierten Ti Plasmide entweder aus dem pTiBo542 oder dem pTiC58 Plasmid

LBA4404 hat den chromosomalen Hintergrund Ach5 vom Oktopin-Typ und das vom pTiAch5-Plasmid abgeleitete Ti-Plasmid pAL4404 vom Oktopin-Typ

kleine Pflanzengröße, kurze Generationszeit, große Menge an Samen, relativ kleine Genomgröße und leichte Transformierbarkeit durch A. tumefaciens

Wurzelzellen von A. thaliana sind für die Regeneration kompetent, können leicht in großen Mengen gewonnen und in Dauerkulturen erhalten werden

Wachstumstemperatur der Pflanze, die Zeit und Temperatur der Ko-Inkubation von Pflanze und Bakterien, die Lichtintensität und -dauer, die Zugabe von AS, die Vorbehandlung mit Phytohormonen, verschiedene A. thaliana-Ökotypen, verschiedene A. tumefaciens-Helferstämme und andere Faktoren (

optimale Wachstumstemperatur für Arabidopsis liegt bei 25°C

wächst A. tumefaciens zwar gut bei 28°C, aber die Akkumulation einiger der VirB-Proteine, die die T4SS-T-DNA-Transportmaschinerie bilden, sowie die Virulenz auf der Wirtsart Kalanchoe werden bei dieser Temperatur stark beeinträchtigt

A. tumefaciens seine Virulenz verlieren, wenn es bei 37o C kultiviert wird, was auf den Verlust des Ti-Plasmids in den Bakterien zurückzuführen ist

Transformationseffizienz ist bei Dauerlicht höher als bei einer Photoperiode von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit

hohen Transformationshäufigkeit ist die Zugabe von 50-200 μM AS, einem natürlichen Wundreaktionsmolekül, zur A. tumefaciens Kultur vor oder während der Koinkubationsperiode, um die Expression von Virulenzgenen in den Bakterien vollständig zu induzieren -> Koinzubationszeit zwei Tage nicht überschreiten sollte, um ein Überwachsen der Bakterien zu vermeiden

-> Nach der Koinzubation von Bakterien und Wurzelexplantat können den Selektionsmedien verschiedene Antibiotika wie Carbenicillin, Cefotaxim, Vancomycin HCl oder Timentin zugesetzt werden, um A. tumefa- ciens zu eliminieren.

antibakterielle Kombination, die aus dem halbsynthetischen Antibiotikum Ticarcillin-Dinatrium und dem β Lactamase-Inhibitor Clavulanat-Kalium besteht und häufig in A. thaliana Wurzeltransformationsmethoden

vom Opine-Typ weisen unterschiedliche Virulenzgrade bei verschiedenen Pflanzenarten auf, was zum Teil darauf zurückzuführen ist, dass die tzs- und virF-Gene nur in einem Typ von Ti-Plasmid vorhanden sind. Es wurde vorgeschlagen, dass A. tumefaciens Stämme vom Nopalin-Typ für die Transformation von A. thaliana und anderen Pflanzen aus der Familie der Brassicaceae vorzuziehen sind

die Ökotypen Aua/Rhon (Aa-O), Bensheim/Bergstras- se (Be-O), Wassilewskija (Ws), Columbia (Col-O) und C-24 sind anfälliger für die Wurzeltransformation durch A. tumefaciens

Explantate auf Medien vorkultiviert werden, die die Phytohormone Auxin und Cytokinin enthalten

• A. thaliana-Ökotypen wie Antwerpen (An-1), Angleur (Ang-0), Bologna (Bl-1), Blanes/Gerona (Bla-2), Calver (Cal-0) und Dijon-G sowie mutierte Linien sind resistent gegen Transformation und/oder Regeneration

• führt die Regeneration ganzer Pflanzen aus transformierten somatischen Zellen manchmal zu so- matischen Mutationen

• Vorhandensein von Phytohormonen in der Gewebekultur während der Regeneration erhöht ebenfalls die Wahrscheinlichkeit von somatischen Mutationen

• Imbibition von keimenden A. thaliana-Samen mit einem geeigneten A. tumefaciens-Stamm in der nächsten Generation transformierte Nachkommen erzeugen kann -> angewandt, um die ersten durch Insertion mutierten Linien von A. thaliana zu erhalten

• reproduktive Blütenstände abgeschnitten und die verletzten Stellen mit A. tumefaciens inokuliert wurden. Die behandelten Pflanzen wurden bis zur Reife gezogen, geerntet und die Nachkommenschaft auf Transformanten untersucht -> Schritte der Gewebekultur und die daraus resultierende somaklonale Variation vermieden, und es ist nur eine relativ kurze Zeit erforderlich, um transformierte Nachkommen zu erhalten. Die Häufigkeit, mit der in der nächsten Generation Transformanten erhalten werden, ist jedoch sehr unterschiedlich und für die Routineanwendung manchmal nicht geeignet.

• entwurzelten A.-thaliana-Pflanzen mit der entsprechenden A.-tumefaciens-Kultur vakuuminfiltriert wurden, die infiltrierten Pflanzen dann sofort wieder eingepflanzt wurden und die geernteten Samen schließlich auf erfolgreiche Transfor- manten untersucht wurden -> Notwendigkeit von Gewebekulturen oder Regenerationsschritten gänzlich auszuschließen -> nützlichkeit eigeschränkt durch Entfernen und Umpflanzen

• Eintauchen von Blütenständen im frühen Blühstadium in eine A. tumefaciens-Suspension ausreicht, um erfolgreiche Transformanten zu erhalten -> Vakuuminfiltration entfallen

A. tumefaciens Stämme Medien kultiviert-> Pellet (Zentrifugation)-> resuspendiert 5 %Saccharose und Tensid Silwet L-77 enthält (0,005-0,02% sonst giftig)

Wiederholte Anwendung, 1 Tag besprühen (feuchtigkeit) erhöhen chancen

0,1 bis 3,0 % der Samen als transgen eingestuft

Vorteil: braucht keien fachleute, geringer Arbeitsaufwand regenerations Probleme gelösst, wenig geräte nötig

Erzeugung von T-DNA-Insertionsmutantenlinien von A. thaliana im Hochdurchsatzverfahren

Zeitpunkt wichitg : damit A. tumefaciens in das Innere des Gynoeceums eindringen kann, bevor sich die Locula schließt

• Erstens wurden nach der Inokulation von A. tumefaciens auf Pollen-Donor-Pflanzen keine transformierten Nachkommen erhalten, während nach der Inokulation von A. tumefaciens auf Pollen-Empfänger-Pflanzen 0,48 % der transformierten Nachkommen erzeugt wurden

• Zweitens wurden verschiedene Promotoren, die mit einem GUS Markergen fusioniert waren, verwendet, um die Stellen zu beobachten, an denen die T-DNA übertragen wurde -> Eizellen der Blüten und nur selten in den Pollen beobachtet,

• Drittens enthalten die meisten Transformanten T DNA, die aus dem ursprünglichen Chromosomensatz stammt, wie aus einer genetischen Verknüpfungsstudie hervorgeht

ortschrittliches und leistungsfähiges Instrument für die Genom-Editierung in eukaryontischen Zellen

Cas9-En-Donuklease von Streptococcus pyogenes und eine einzelne chimäre Leit-RNA (sgRNA), um DNA-Doppelstrangbrüche in gezielten Genomsequenzen zu erzeugen.

schnelle Alternative zur Untersuchung der Genfunktion, des Promotorverhaltens und der Proteinfunktion wenn die Erzeugung einer stabilen transgenen Linie nicht erforderlich ist

Ein bi- närer Vektor, der ein Reportersystem (d. h. einen Promotor von Interesse, der mit einem GUS-/Luciferase /Fluoreszenzproteingen fusioniert ist) oder ein durch einen konstitutiven Promotor angetriebenes Fu- sionsprotein (z. B. für die Untersuchung der subzellulären Lokalisierung, der Proteinaktivität oder der Protein-Protein-Interaktion) trägt, kann auf natürliche Weise verarbeitet werden, um einzelsträngige T DNA zu erzeugen und in den Zellkern des Wirts zu bringen. Im Wirtskern kann die einzelsträngige T-DNA in doppelsträngige T-DNA synthetisiert werden, die leicht transkribiert und in das Trägerprotein/Fusionsprotein übersetzt werden kann, um ohne Genomintegration analysiert zu werden. Die transiente Transformation kann auch zum Gen-Silencing verwendet werden, indem kleine interferierende RNAs (siRNAs) und microRNAs (miRNAs) in Pflanzengewebe exprimiert werden

-> integration nicht hauptzweck Pflanzenmarker nicht notwendig

Nachteil: Sehr variable Transformationseffizienz für einzelne Agrobacterium-Stämme, Zielpflanzenarten und spezifische Gewebe

Cellulose

CSLA9 Promotor (dehnungszone)

RTNLB1 (reticulon-like protein B-1, At4g23630), das mit dem T-Pilus-Protein VirB2 von A. tumefaciens interagiert, ist wichtig für die Effizienz der stabilen und transienten Trans- Wurzelexplantaten

Infektionsstelle (auch bekannt eine als "Haarwurzelkrankheit") und so manipuliert werden kann, dass er die auf einem binären Vektor getragene T-DNA in die Wurzelzellen überträgt

->schnelles und wirksames Instrument zur Untersuchung der Funktion von Genen zu sein, die an der Wurzelbiologie beteiligt sind

Wurzlgewebe eignet sich nicht für Experimente im Zusammenhang mit der Verteidigung, den Chloroplasten oder der Reinigung von Proteinen

Obwohl verschiedene opinproduzierende Stämme in bestimmten Pflanzenarten besser zu funktionieren scheinen, bleibt unklar, ob die Spezifität der Opinverwertung zu einer unterschiedlichen Transformationseffizienz in bestimmten Pflanzenarten beiträgt

Phenole die Effizienz der transienten Transformation beeinflussen

Wie bei der stabilen Transformation ist es jetzt üblich, während der Transformation AS zuzusetzen.

der transienten Transformation erhöhen (Mangano et al., 2014). Detergenzien/Tenside werden auch verwendet, um die kutikuläre Penetration von Flüssigkeit auf Blattoberflächen zu verbessern. Silwet L-77 ist eines der am häufigsten verwendeten Tenside bei der transienten Transformation, während Triton X-100 die Effizienz nachweislich deutlich erhöht

nahG (einer bakteriellen SA-Hydroxylase), die Arabidopsis-Pflanzen exprimiert, auch die Effizienz der transienten Transformation in Arabidopsis-Blättern erhöhen kann

Arabidopsis erkennt den A. tumefaciens Elongationsfaktor EF-Tu über eine transmembrane Leucine-rich repeat (LRR)-Rezeptor-Kinase, EFR (At5g20480), um nachgeschaltete Immunreaktionen auszulösen

Effektor AvrPto aus dem Pflanzenbakterium Pseudomonas syringae schwächt die Immunität von Arabidopsis, indem er auf mehrere Mustererkennungsrezeptoren -> AvrPto nur dann exprimiert, wenn DEX verabreicht wurde

Vorteil, dass die Analyse im zellulären Kontext der gesamten Pflanze durchgeführt werden kann -> schnelle und bequeme Protokolle für eine vorläufige Analyse von nicht charakterisierten Genen und Strukturen bereitzustellen

Vakuuminfiltration -> Adsorption ganzer A.-thaliana-Keimlinge von Agrobakterienzellen zu erleichtern

ohne Vakuum: Fast Agrobacterium mediated seedling trans- formation (FAST)-Protokoll optimierten Zelldichte /Konzentration von Silwet L-77 (0,005%)