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ÜBUNGSFRAGE - Sigma Faktoren

1. Was ist ein Sigma-Faktor?

Der Sigma-Faktor ist eine Untereinheit, mithilfe welcher das Kernenzym aus den Untereinheiten alpha, alpha’, beta und beta’ das Holoenzym bildet. Der Sigma-Faktor erkennt die Promotorsequenz auf der DNA und kann so die Transkription eines spezifischen Gens einleiten.

1. (ÜF) Warum haben Bakterien mehr als nur einen Sigma-Faktor?

Der Sigma-Faktor ist austauschbar, kann spezifische Gene erkennen und so die Genexpression beispielsweise an Stresssituationen wie Hitzeschock oder N2-Mangel anpassen.

1. Nenne ein Beispiel für ein Bakterium, welches nur einen sigma-Faktor besitzt.

Mycoplasma genitalium

Mycoplasma genitalium and its close relative Mycoplasma pneumoniae possess a primary sigma-70 factor (MG249 and MPN352, respectively) but no alternative sigma factors have been characterized.

(doi 10.1093/nar/gkv422)

1. Haben Eukaryoten sigma-Faktoren?

Nein.

ÜBUNGSFRAGE - Sigma-Faktoren

1. Beschreibe die Funktion von sigmaFaktor 70 aus E.coli

• Targetgene von sigma70 sind Haushaltsgene

• Transkriptionsinitation aller E.coli Gene derer Produkt unter normalen Bedingungen benötigt wird

• -35/-10 Region (TATA)

• Genname rpoD

  
  

  1. Beschreibe die Funktion von sigmaFaktor 32 aus E.coli

• aktiviert Targetgene bei Hitzeschock

• Genname rpoH

• -35/-10 Region (CCCC)

  
  

  1. Beschreibe die Funktion von sigmaFaktor 54 aus E.coli

• wird bei N2 Mangel aktiviert und induziert das Enzym Glutaminsynthetase

• Genname rpoN

• -24/-12 Region (TTGC)

• etwa 60 Prozent der bakteriellen Genome in der EBIDatenbank besitzen einen putativen sigma54

1. Erläutere kurz die Funktion der Glutaminsynthetase, welche durch sigma 54 induziert wird

Die Glutaminsynthetase verstoffwechselt Glutaminsäure und Ammoniumionen in Glutamin. Glutamin dient als Transport von Stickstoff (Ammoniak). Endogene Reaktion (ATP abhängig)

KLAUSURFRAGE - Topoisomerasen

1. (KF) Was sind die grundlegenden Eigenschaften von Topoisomerase I?

• Topoisomerase 1 schneidet einen Einzelstrang DNA Strang, fädelt den anderen Strang hindurch und ligiert den geschnittenen Strang.

• das tut sie ATP unabhängig

• sie kann so neg Superspiralisierung entwinden

1. (KF) Was sind die grundlegenden Eigenschaften von Topoisomerase II?

• auch Gyrase genannt

• erzeugt einen Doppelstrangbruch

• das tut sie ATP abhängig

• legiert den Doppelstrang wieder

• erzeugt so neg Supercoiling

• Entwindung der DNA mit ca 10bp pro Windung

• führt zu Platzgewinn und besserer Ablesbarkeit

  
  

1. Welchen Einfluss haben Topoisomerase I und II auf die Transkription?

• die Superhelikalität der DNA beeinflusst die Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor

• während er Replikation wird neg und pos Supercoiling entzeugt welche durch Topo I und II wieder ausgeglichen werden müssen

1. Was hat noch einen Einfluss auf die Transkription?

• Spacer (Region zwischen bsp. -35 und -10)

• GC (3WBB) oder AT(2WBB) Basenpaarungen am Transkriptionsstart +1

1. Nenne ein Beispiel wie die Transkription in Bakterien zielgerichtet manipuliert werden könnte.

   • durch genetische Mutation am Promotor

1. Shine-Dalgarno-Sequenz liegt auf…

   • der mRNA - Ribosomenbindestelle

     
     

2. Der UTR auf der mRNA steht für

   • Untranslatierter Bereich

3. Bei der Synthese der RNA wird von der DNA abgelesen der…

   • kodogene Strang (Antisense)

     
     

4. Alle Gene kodieren für Proteine. Richtig oder Falsch?

   • falsch

5. Ordne mRNA, rRNA und tRNA sowie sRNAs nach ihrer tendenziellen Größe

   • sRNA - tRNA- rRNA - mRNA

6. Welche RNAs werden am häfigsten transkribiert?

   • rRNA

     
     

     Warum können mRNAs leichter abgebaut werden als tRNAs und rRNAs?

   • aufgrund spezifischer Faltung die vor Abbau schützt

1. Wahr oder Falsch? Die RNAPol…

   • braucht Mg2+ als Kofaktor WAHR

   • braucht Eisen als Kofaktor FALSCH

   • ist nicht die einzige RNA Polymerase in Bakterien FALSCH

   • braucht keinen Primer RICHTIG

   • hat eine geringere Fehlerrate als die DNAPol FALSCH (DNA hat proof reading)

   • Ist langsamer als die DNA Pol WAHR

2. In welche Richtung synthetisiert die RNA Pol RNA?

   • 5’ zu 3’

3. In welche Richtung liest die RNAPol die DNA ab?

   • 3’ zu 5’

4. Termination: Was ist ein intrinsischer Terminator?

Nach dem Stop Codon kommt es downstream zu einem Palindrom

Nach Übersetzung in RNA bildet diese eine Stammschleife aus die zur Termination führt.

1. Wo löst sich die RNAPol auf?

Bei Übersetzung des Poly-U-Schwanz, wird die RNA DNA Bindung geschwächt und stört RNAPol Komplex.

1. Was ist ein Nucleoid?

   • dort ist die DNA von Mikroben effizient verpackt.

2. Besitzen Prokaryoten Histone?

   • nein, die Verpackung erfolgt mithilfe von DNA Bindeproteinen

3. In welcher Form liegt die DNA im Nucleoid vor?

   • Rosetten-Form

KLAUSURFRAGE - NAPs

(Altklausurfrage) Nenne 4 Regulationsmechanismen von NAPs

Inhibierung durch Trapping

Sequenz down und upstream werden nurch NAPs gebunden und die RNApol gelangt so nicht an Transkriptionsstart

Inhibierung durch Silencing

NAPs binden am Promotor und blockieren diesen.

Aktivierung durch RNA-Pol Kontakt

NAPs interagieren mit RNA-Pol und stimulieren diese.

Loop-vermittelte Aktivierung durch RNA-Pol Kontakt

Loop induziert RNA-Pol Bindung an Promotor

VORLESUNGSFRAGEN DNA Bindeproteine

DNA Bindeproteine binden DNA spezifisch oder unspezifisch und sind meist Dimere. Für NAPs gibt es zwei Paradebeispiele:

1. Was macht das Head-unstable Protein HU?

   
   

   Das HU kann als Dimer in die kleine Furche binden und die DNA so umhüllen und für eine Spiralisierung sorgen.

1. Was macht der Integration Host Factor IHF?

   Der IHF kann durch seine beta Faltblätter an die DNA binden und sie so krümmen. IHF kann so die Interaktion von entfernten Regulatoren ermöglichen.

Regulation der Transkription kann auch durch Bindeproteine stattfinden, die sequenzspezifisch binden. Dabei unterscheiden sich die Bindestellen für Aktivatoren und Repressoren.

1. Wo finden sich tendenziell Bindestellen von Aktivatoren im Vergleich zu Repressoren auf der DNA?

Aktivator-Orte (-40/-60) liegen deutlich weiter hinter dem Transkriptionsstart als Repressor-Orte (+20/-40)

Werfen wir einen genaueren Blick auf die Repressoren:

1. Es gibt drei Varianten wie ein Repressor die Transkription verhindern kann, welche?

Variante 1a: Sterische Behinderung, indem der Regulator am Promotor bindet, so dass die RNA-Pol nicht binden kann.

Variante 1b: Sterische Behinderung, indem der Repressor am Operator ( hinter dem Promotor) bindet und so die Elongation der RNAPol verhindert.

Variante 2: Durch Schleifenbildung kommt die RNA Pol nicht an den Promotor

Variante 3: Durch Modulation des Aktivators

ÜBUNGSFRAGE/KLAUSURFRAGE

DNA-Erkennung von DNA Bindeproteinen kann auch sequenzspezifisch erfolgen durch bestimmte Motive in den Proteinbindedomänen.

1. Nenne fünf bekannten Motive.

   • Helix turn Helix

   • Zinkfinger

   • Leucin-Reißverschluss bzw. Helix lopp Helix

   • beta Faltblätter

   • TAL Effektoren

2. Beschreibe das Helix turn Helix Prinzip:

Im Helix turn Helix Schema gibt es eine stabilisierende Helix und eine Erkennungshelix, deren Aufgabe die Drehung des Proteins ist. Die DNA Bindung erfolgt nicht kovalent durch WBB und Van der Vaals Kräfte in der großen Fruche der DNA. Ein Beispiel ist der Lambda-Repressor.

1. Beschreibe das Zink-Finger-Motiv:

Das Zinkfinger-Motiv besteht aus einer Erkennungshelix und einem Zinkion koordiniert durch zwei Cysteine und zwei Histidine, ein entsprechendes Protein, meist Regulatorproteine enthält i.d.R zwei solcher Motive, diese beiden binden dann in der großen Fruche der DNA Doppelhelix.

1. Beschreibe das Helix Loop Helix Motiv bzw. Leucin Reißverschluss

Zwie Helices stehen sich gegenüber mit Leucin-REsten, welche nicht mit der DNA interagieren sondern zwei Erkennungshelices ausrichten, so dass diese in der großen Furche der DNA binden können.

1. Beschreibe das beta Faltblatt-Motiv:

Z.B. MetJ, steuert die Methionin Biosynthese. Meist Homodimere, jedes Monomer hat ein beta Faltblatt, welches in der großen Furche der DNA bindet, bzw. im Fall von MetJ am Operator (MetBox - ist ein Palindrom). MetJ wiederum wird durch den CoFaktor SAM reguliert.

VORLESUNGSFRAGE

Zwei Karten zuvor haben wir uns angesehen wie ein Repressor die Transskription verhindern kann. Zum einen durch sterische Hinderung, indem der Repressor an den Promotor bindet, aber auch durch Schleifenbildung oder Modulation des Aktivators. Schauen wir uns jetzt an wie ein Aktivator wirken kann.

1. Nenne drei Wege, wie ein Aktivator die Replikation beeinflusst.

a. Klasse 1 Aktivierung: Der Aktivator interagiert mit der alpha UE der RNA-P.

b. Klasse 2 Aktivierung: Der Aktivator interagiert mit sigma Faktor und der -35 Region.

c. Aktivierung durch Konformationsänderung - Aktivator interagiert mit Spacer Region und sigma Faktor

1. Nenne vier klassische Wege, wie Regulatorproteine Signale aufnehmen können.

a. Modifikation, z.B. +P, +Me, +Ac

b. Durch Bindung von Effektoren

c. Kontrolle der Menge (zb. durch eig Transkriptionskontrolle oder kontrollierten Abbau)

d. Titration an einen Ort, wo die DNA nicht erreicht werden kann, räumliche Trennung

1. Erläutere kurz in Worten, was auf dieser Folie zu sehen ist:

Am Beispiel der Repression ist gezeigt, wie durch Argininzusatz die Enzyme zur Argininbiosynthese mengenmäßig nicht mehr ansteigt -> Enzyme der Argininbiosynthese sind reguliert durch die Menge von Arginin.

Am Beispiel der Infuktion ist zu sehen, dass durch das Hinzufügen von Lactose b-Galactosidase mengenmäßig ansteigt - > b Galactosidase ist an die Menge von Lactose gebunden

VORLESUNGSFRAGE

Weiter mit der Regulation der Regulatoren. Aktivatoren und Repressoren müssen reguliert werden. Wie beschrieben können Regulatoren Signale aufnehmen durch Phosphorylierung oder Acetylierung, ihr Abbau oder die eigene Tranksirption können reguliert werden. In diesem Zusammenhang sprechen wir auch von Koaktivatoren oder Korepressoren, als auch Induktoren.

1. Beschreibe was ein Koaktivator/Korepressor tut.

Korepressor bindet an Repressor, Koaktivator an Aktivator -> führt zur DNA Bindung und so zu Aktivierung bzw Repression

1. Was tut ein Induktor:

Bindet an Repressor, Repressor löst sich -> Transkritption induziert.

1. Ein Beispiel für den Wirkmechanismus

des Korepressors ist die Repression der Argininsynthese. Beschreibe:

Arginin wirkt als Korepressor. Das bedeutet, Arginin bindet als Korepressor an den Repressor, welcher so an den Operator binden kann und die DNA-Polymerase, welche bereits am Promotor gebunden hat blockiert. So können sie Strukturgene nicht abgelesen werden, und es bildet sich kein neues Arginin. Wenn es dann wieder zu einem Argininmangel kommt, kann Arginin nicht mehr als Korepressor an den Repressor binden, sodass die RNA-Polymerase wieder arbeiten kann. smaaaart.

1. KLAUSURFRAGE: (die wird jedes Jahr gestellt) Wie kann das lac-Operon negativ und positiv reguliert werden?

a. positiv-Kontrolle: durch Enzyminduktion

In Abwesenheit von Laktose als Induktor bindet der Repressor an das Operon und verhindert die Transkription. Kann Laktose als Induktor wirken, bindet er an den Repressor, so dass der Repressor sich lösen kann und die RNA-Polymerase voranschreiten kann.

b. negative Kontrolle: in Form einer globalen Kontrolle

(Übungsfrage 3: Erklären sie wie ein Aktivatorprotein an der Katabolitrepression beteiligt sein kann)

• ist genügend Glucose vorhanden, wird der second messenger cAMP (cyklisches AdeninMonoPhosphat) aus der Zelle geschleust

• fehlt hingegen Glucose kann cAMP an das Catabolite Activator Protein CAP binden. Das cAMP/CAP-Komplex bindet als Aktivator an die CAP Bindestelle vor den Promotor der beta-Galactosidase und aktiviert die Transkription zur Synthese von beta Galactosidase, welche Lactose abbauen kann um Energie zu gewinnen. Der Grund warum dies an Glucose gekoppelt ist, ist weil Glucose der bessere Energielieferant ist: ergo es wird erst Glucose und dann Lactose abgebaut. Das nennt sich auch die Katabolit Repression, bzw den Glucose Effekt.

1. last but not least, beschreibe die Induktorrolle von Maltose

Maltose bindet an das Maltoseaktivatorprotein und induziert so die Bindung der RNAPol an den Promotor.

ÜBUNGSFRAGE

Ein weiterer Mechanismus ist die “stringente Antwort”.

1. (Übungsfrage 6) Welche Gene werden bei der sog. “stringenten Antwort” aktiviert und warum?

Gelangt eine tRNA in ein Ribosom, ohne mit Aminsoäuren beladen zu sein, aktiviert das Ribosom die RelA-Synthetase, welche Alarmhormone synthetisiert nämlich ppGpp und pppGpp. Diese sorgen für ein Abfall der rRNA und tRNA Produktion und aktivieren Operons für die Proteinbiosynthese.

1. (Übungsfrage 7) Welche Rolle spielen Kinasen bei bakteriellen ZWei-Komoponenten-System?

Ich nenne es auch die Phosphor-Uhr. Von einer Sensorkinase an der äußeren Zellmembran wird ein Metabolit wahrgenommen, z.b. O2, Nitrit ect. Die Sensorkinase bewirkt eine ATP abhängige Autophosphorylierung. Anschließend kommt es zu intrazellulären Phosphatübertragung an einen Responeregulator. Dieser wird dadurch aktiviert und bindet an die DNA am Operator und blockiert somit die RNA Polymerase. Wird der Responseregulator dephosphorylisiert, wird er inaktiviert durch eine Phosphatase und alles nimmt seinen gewohnten Gang. feeeeeeeeeeertig!!!!!!!!

Halt ich weis immer noch nicht welche rolle da eine kinase spielt.