Chromatographie

aufgrund der z. T. extrem leistungsstarken Trenn-, Nachweis- und Auswerteverfahren werden chromatographische Verfahren angewendet bei:

• quantitativer Spurenanalyse

• hochauflösenden Trennungen komplexer Gemische

• Probenvorbereitung

• Stoffanreicherung bzw. Abtrennung von störenden Begleitstoffen

• Bestimmung thermodynamischer und kinetischer Größen

Strukturaufklärung/Identifizierung durch Anwendung von Kopplungstechniken (Stofftrennung und Spektroskopie) möglich

• Adsorptionschromatographie

• Verteilungschromatographie

• Affinitätschromatographie

• Ausschlusschromatographie

• Ionenchromatographie

• Planare Chromatographie (stationäre Phase in einer Ebene, z.B. auf einer Platte oder als Papier)

  • Dünnschichtchromatographie DC

  • Papierchromatographie PC

  • Gelelektrophorese

• Säulenchromatographie (stationäre Phase in einer Säule)

  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HPLC

  • Gaschromatographie GC

  • Überkritische Fluid-Chromatographie SFC

  • Kapillarelektrophorese CE

• Stofftrennung

• zentrale in der Analytik überwiegend organischer Stoffe

• physikalische Trennmethode

  • Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer immobilen (stationären) und einer sich bewegenden (mobilen) Phase

  • kontinuierlicher Stoffaustausch zwischen den beiden Phasen

• Trennmechanismen

  • Adsorption

  • Verteilung

  • Ionenaustausch

  • Molekülausschluß (Gelpermeation)

  • Affinitätschromatographie

• Chromatographisches System

  • besteht aus zwei nicht miteinander mischbaren Phasen, wobei sich die eine an der anderen vorbeibewegt

• Trennung erfolgt aufgrund unspezifischer WW - Adsorption an einer Feststoffoberfläche

  • HPLC an Normalphasen

  • DC

  • GC

    
    

• Trennung nach den Prinzipien der Verteilung zweier nicht mischbarer Stoffe

  • HPLC an Umkehrphasen

  • DC

  • GC

• Trennung nach dem Prinzip des Molekülgrößenausschlusses an unterschiedlich großen Poren

  • Gelpermeationschromatographie GPC

    
    

• Flüssig-Flüssig-Chromatographie

• Flüssig-Fest-Chromatographie

• Gas-Flüssig-Chromatographie

• Gas-Fest-Chromatographie

• mobile Phase ist eine Flüssigkeit, stationäre ebenfalls, wobei letztere an einem festen Träger fixiert ist

  • HPLC

  • GC

  • DC

  • PC

• mobile Phase ist eine Flüssigkeit, stationäre ist fest

  • HPLC

  • GC

  • DC

  • PC

• experimentelle Bedingungen müssen konstant und reproduzierbar sein

• Vorrat an mobiler Phase

• Fördersystem

• Probenaufgabe

• Säule

• Detektor

• Auswerteeinheit

• mobile Phase ist ein Gas, stationäre ist fest

• kontinuierliche Nachlieferung für konstanten Fluss, z.B. Eluentenflasche, Gasflasche

• Eluent=Wasser, Lösungsmittel

• reproduzierbarer Transport der mobilen Phase, variabel einstellbar z. B. Kolbenpumpe, Druckgasflasche

• chromatorgraphische Säule und ihre Halterung, u.U. Thermostatierung, totvolumenarme Anschlüsse der Fließwege, z.B. Kapillarsäule im Säulenofen

• Einbringen der Probe in strömenden Fluss der mobilen Phase

• Reproduzierbarkeit ist entscheidend für Quantifizierung

• z. B. Eindrehschleife

• Umwandlung konzentrationsproportonaler chemischer oder physikalischer Substanzeigenschaften in elektrische Signale z. B. UV/VIS-Detektor, Wärmeleitfähigkeitsdetektor

• verschiedene Stoffe durchwandern eine vorgegebene Trennstrecke mit unterschiedlicher Geschwindigkeit

• Stofftransport erfolgt mit konstanter Geschwindigkeit

• jeder Stoff hat eine andere Retentionszeit in der stationären Phase (Verteilung/Adsorption)

• tR= ts + tm

  • tR: Gesamtretentionszeit

  • ts: Retentionszeit in stationärer Phase (Aufenthaltswahrscheinlichkeit)

  • tm: Aufenthaltszeit in der mobilen Phase

• tR ist direkt aus Chromatogramm ablesbar

• K=cS/cM

  • K= Verteilungskoeffizient

  • cS= Konz. in stationärer Phase

  • cM= Konz. mobile Phase

• Übergang der Teilchen zwischen der mobile Phase und der stationären Phase wird durch ein Verteilungsgleichgewicht bestimmt

• K kann nicht direkt aus dem Chromatogramm entnommen werden

• direkt ablesbar ist tR

• Visualisierung der elektrischen Signale im Detektor

  • Analogsignal-Ausgabe, z. B. Schreiber

  • Analog/Digitalwandlung und Digitalsignal-Ausgabe, z. B. Computer

• tR: Gesamtretentionszeit (Zeit die Verbindung braucht um Säule zu durchdringen)

• tm: Totzeit der Säule (Zeit die mobile Phase benötigt um von Ort der Probenaufgabe durch Säule bis zum Detektor zu wandern)

• ts: Nettoretentionszeit (Zeit in der Analyt sich in stationärer Phase aufhält)

• mittlere Wanderungsgeschwindigkeit: v=L/tR bzw. u=L/tM

  • v= Geschwindigkeit Verbindung

  • u = Geschwindigkeit mobile Phase

  • L = Länge der Säule

• Retention einer Substanz entspricht ihrer Aufenthaltsdauer in der mobilen Phase

• nicht zurückgehaltene Komponenten befinden sich die gesamte Zeit in der mobilen Phase (kein Aufenthalt in stationärer)

• Substanzen die mit stationärer Phase WW eingehen verweilen im Vergleich zu durchlaufenden Verbindungen viel kürzer in der mobilen Phase

• dieser Zeitanteil kann durch das Verhältnis der Masse des Analyten in der mobilen Phase zur Gesamtmasse des Analyten in der Säule beschrieben werden

• K=cS/cM (Verteilungskoeffizient)

• Es ergibt sich der Kapazitätsfaktor k´ (Maß für die Verteilung und tR): k´= (tR-tM)/tM

  • sollte zwischen 1 und 5 liegen

  • kleiner 1 werden die Verbindungen zu schnell eluiert (tR fast tM)

  • größeer 20 ergibt zu lange Retentionszeiten

• Trennung beruht auf Ionenaustauschvorgängen

  • Anionenchromatographie

  • Kationenchromatographie

• Breite eines Peaks im direkten Zusammenhand mit Trennleistung/Säuleneffizienz

• Bewegt sich eine Substanz entlang der Säule, bedeutet dies einen schrittweisen Übergang von einer Trennstufe bzw. äquilibrierten mobilen Phase zur nächsten (Einstellung eines GGW zwischen stat. und mobiler Phase für jede Substanz, Bodenhöhe und Trennstufenanzahl)

• Trennstufenanzahl: N = L/H

  • Je kleiner H (Trennstufenhöhe), desto höher ist die Effizienz und Auflösung der Säule

• Bestimmung Trennstufenanzahl aus Chromatogramm: N = 16 (tR/w)^2 bzw. N = 5.54 (tR/b0.5)^2

• Peakverbreiterung ist auf einen kinetischen Effekt zurückzuführen

  • rührt von geschwindigekeitsbegrenzender Massenübertragung entlang der Säule her

  • Größe Effekt hängt von der Dauer möglicher Übergänge zwischen den beiden Phasen ab und ist damit direkt proportional zur Strömungsgeschwindigkeit der mobilen Phase

• alpha = KB/KA

• alpha = k´B/k´A

• Lineargeschwindigkeit

• Diffusionskoeff. in der mobile Phasen

• Diffusionskoeff. in der stat. Phasen

• Partikeldurchmesser Packungsmaterial

• Filmdicke immobilisierter Flüssigkeit der stat. Phase

• Desorptionsgeschw. des Analyten

• Säuelendurchmesser

• mobile Phase ist ein Gas, stationäre Phase ist eine an einem festen Träger fixierte Flüssigkeit

  • GC

• Trennung erfolgt aufgrund von spezifischen WW - Schlüssel/Schloss Prinzip (z.B. Biomoleküle)

  
  

Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung (Massenübergangsterm)

• beschreibt Peakverbreiterung aufgrund des Zeitbedars für den Wechsel von mobiler zur stat. Phase und zurück. Hängt bspweise von der Eintauchtiefe des Probenmoleküls zusammen (bei flüssiger mobilen Phase

• zu kleinen Werten führen:

  • langsame Fließgeschwindigeit (viel Zeit zur GGW-Einstellung)

  • niedrige Viskosität der mobilen PHasen

  • feinkörniges Material bei Adsorption bzw. geringe, jedoch vollständige Belegung der flüssigen stationären Phase bei der Verteilungschromatographie

benötigt wird ein niedriges H und eine flache H(u)-Funktione

• geringe Korngrößen fester bzw. flüssiger stat. Phasen

• homogene Packunger der stat. Phase unter Verwendung engverteilter Packungsmaterialien

• kleine Säulendurchmesser

• große Diffusionskoeff. in der stat. Phase und kleine Diffusionskoeff. in der mobilen Phase.

  • in GC können die Diffkoeff. in der moblien Phase durch niedrige Temperatur deutlich verringert werden

Trennstufenzahl der später eluierenden Komponente B (Auflösung muss bekannt sein):

• Maß für die Fähigkeit des Systems mit den gewählten chromatiographischen Bedingungen zwei Analyten zu trennen

• ausreichend ist eine Auflösung größer 1,5 (bei 1,5 überlappen noch 0,3% der Peakflächen)

Unter Einbeziehung von N, k´ und alpha ergibt sich für Rs:

Diffusion in Längsrichtung (Longitudinal-Diffusion)

• hohe Fließgeschwindigkeiten (wenig Zeit zur Diffusion) und unverzweigte Poren der stationären Phase führen zu kleinen B/u - Werten

• H = A + (B/u) + CuStrich

  • A = Eddy-Diffusion

  • B = Longitudinaldiffusion

  • C = Massenübergang

• beschreibt Trennstufenhöhe in Abhängigkeit von der linearen Strömungsgeschwindigekti der mobilen Phase durch die Konstanten A,B,C

• bei optimaler Geschwindigkeit hat H ein Minimum

Eddy-Diffusion (Streudiffusion)

• Moleküle legen den Weg durch die Trennstrecke mit unterschiedlicher Geschwindigkeit zurück (z. B. verschiedene Wege durch gepackte Säule)

• klein A-Werte entstehen durch homogene Packung und Teilchen einheitlicher Größe