Nitschke

Mentimeter-Umfragen

1. Eigenschaften von Transkriptionsfaktoren

   a. können alleine Transkription induzieren

   b. funktionieren nur mit DNA Polymerasen

   c. funktionieren nur mit RNA Polymerasen

   d. jeder TF steuert nur ein Gen

2. Wofür gab es den Nobelpreis 2024?

   a. Entdeckung der microRNAs

   b. Modifikation von RNA und Impfstoffentwicklung

   c. RNA Interferenz

3. Was ist eine Transaktivierungsdomäne?

   a. Damit bindet der Transkriptionsfaktor an die DNA

   b. Damit interagiert ein Transkriptionsfaktor mit dem Präinitationskomplex

   c. Ein Teil eines Promotors

4. Was ist eine Transaktivierungsdomäne?

   a. Teil eines Transkriptionsfaktors

   b. Teil eines Promotors

   c. damit bindet der Transkriptionsfaktor an die DNA

5. Der Transkriptionsfaktor NF kappa B wird….

   a. durch direkte Phosphorylierung aktiviert

   b. durch direkte Dephosphorylierung aktiviert

   c. durch Phosphorylierung und Abbau eines Inhibitors aktiviert

6. Alternatives Splicing…

   a. wird immer durch Regulatorproteine reguliert

   b. ist vielfach ein zufälliger Prozess

   c. kommt eher selten bei menschlichen Genen vor

7. Eine lange (>2000bp) homologe dsDNA wird…

   a. in Pflanzenzellen gespalten und macht RNA Interferenz

   b. in menschlichen Zellen gespalten und bewirkt RNA Interferenz

   c. in menschlichen Zellen keine Auswirkungen haben

VORLESUNGSFRAGEN - Transkriptionsfaktoren in Eukaryoten (Alberts S. 256)

Wir haben schon gelernt: die RNAPol-II ist trotz ihrer strukturellen Ähnlichkeiten zu prokaryotischen RNA-Polymerase nicht in der Lage die Transkription allein zu initiieren. Allerdings besitzt die RNA-Pol-II auch keinen sigma-Faktor. Sie ist also auf andere Proteine angewiesen, sogenannte Transkriptionsfaktoren.

Um die Transkription in Eukaryoten einzuleiten, wird ein Präinitationskomplex (kurz PIC) aufgebaut. Ein entscheidender und erster Schritt ist ein Protein welches an der TATA-Box bindet.

1. Wie heißt dieses Protein?

2. Was tut dieses Protein?

3. Im folgenden baut sich der PIC auf, also der Prä-Initations-Komplex:

Hier vollständig abgebildet. Die Transkriptionsfaktoren (TF) der RNA-Polymerase II (also TFII) des PIC lauten: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH. Bringe sie in die richtige Reihenfolge und erläutere ihr Tun.

(es sei darauf hingewiesen, dass die Abbildung hier aus dem Alberts nicht die genaue Konformation aller TFs an Promotoren abbildet, sie unterscheiden sich normalerweise etwas)

1. TFIIH hat eine Kinase als Untereinheit. Warum?

1. Für die Vervollständigung des PICs sind noch vierweitere Proteine relevant. Identifiziere sie in obiger Zeichnung und benenne ihre Funktion.

2. Wozu dient die Polyphosphorylierung am C-Terminus der RNAPol-II noch außer als Aktivierungssignal?

VORLESUNGSFRAGEN - Wiederholung der eukaryotischen Transkription

Im Backert-Teil haben wir die prokaryotische Transkription ausführlich besprochen. Jetzt schauen wir uns die eukaryotische Transkription genauer an. Es gibt einige Ähnlichkeiten und viele Unterschiede:

Hier die Transkription am Beispiel der Prokaryoten:

ungefähr so sieht es bei den Eukaryoten aus:

Aus diesen Grafiken nicht ersichtlich ist, dass der Promotor stets vor dem Transkriptionsstart liegt.

So wie hier gezeigt. Was wir hier noch sehen: Die Anzahl regulatorischer Elemente nimmt zu, je komplexer das Lebewesen.

Hier die ersten Verständnissfragen:

1. Wieviele RNA Polymerasen gibt es in Eukaryoten?

2. Welche RNA-Polymerase ist für die Transkription in Eukaryoten am wichtigsten?

3. Was versteht man unter Kernextrakt?

4. Ist das Kernextrakt notwendig für eine zielgerichtete und starke RNA-Synthese?

VORLESUNGSFRAGE - Zusammenfassung Prä-Initationskomplex

Schau was du kannst: Benenne jedes der hier gezeigten Proteine und ihrer Funktion:

VORLESUNGSFRAGE/ ÜBUNGSFRAGE 1 und 2: EBF1 und E2A

Auf dieser Grafik kannst du die Bedeutung wichtiger spezifischer Transkriptionsfaktoren ablesen:

Hier haben wie besonders ein Auge auf EBF1 und E2A. Diese kennen wir bereits aus der Entwicklungsbiologie. Sie sind entscheidend für die B-Zell-Entwicklung.

1. Welche DNA-Bindemotive haben E2A und EBF1? Nenne je ein Zielgen.

2. Hier siehst du eine FACS-Untersuchung an EBF1-knockout Mäusen. Was erkennst du?

1. Können EBF1-knockout Mäuse Granulozyten und/oder T-Zellen bilden?

1. B-Zellen entwicklen sich während der VDJ Rekombination von pre-pro-B-Zellen, zu early-pro-B-Zellen und dann zu late pro B-Zellen:

In einer FACS Untersuchung von EBF1-knockout-Mäusen sehen wir das:

Was sagt uns das?

1. Hier die FACS Untersuchung von E2A knockout Mäusen. Was wissen wir über die B-Zell-Bildung?

1. In vielen Genclustern kommen Locus-Control-Regions vor. Wie funktionieren sie? Nenne ein Beispiel.

2. Welche Rolle spielen spezifische Transkriptionsfaktoren? Wie wirken sie in der eukaryotischen Genregulation? Nennen sie Beispiele.

VORLESUNGSFRAGE/KLAUSURFRAGE/MENTIMETERFRAGE/ÜBUNGSFRAGE 3:Genregulation durch Signalketten: Story about CREB, CRE und dem CBP

(aus Alberts S. 582) Alle Zelloberflächen-Rezeptorproteine binden an extrazelluläre Signalmoleküle und übertragen deren Botschaft an ein oder mehrere intrazelluläre Signalmoleküle, die das Verhalten dieser Zelle ändern. Diese Rezeptoren werden aber in drei große Familien unterteilt, die sich hinsichtlich ihres verwendeten Übertragungsmechanismus unterscheiden:

1. Welche drei Klassen von Zellmembran-Rezeptoren kennst du?

Interessant ist, dass der Neurotransmitter Acetylcholin beispielsweise in Skelettmuskelzellen über einen ionen-gekoppelten Rezeptor funktioniert, in Herzmuskelzellen aber über einen G-Protein-gekopptelten Rezeptor.

1. Was sind G-Proteine?

G-Protein gekoppelte Rezeptoren sind die größte Familie membrangebundener Rezeptoren, im Menschen gibt es 700 Arten davon. Diese Rezeptoren vermitteln eine extreme Vielfalt an Antworten auf extrazelluläre Signalmoleküle. Signalmoleküle dieser Rezeptorart können Proteine, kleine Peptide, Aminosäuren oder Fettsäureteilen sein. Etwa die Hälfte aller bekannten Arzneistoffe wirken über GPCRs. Alle GPCRs haben aber eine ähnliche Struktur:

Es handelt sich um eine einzige Polypeptidkette , sie sich sieben mal vor und rückwärts durch die Lipiddoppelschicht schlängelt.

Bindet ein extrazellulärer Botenstoff an einem GPCR ändert dieser seine Konformation. So kann der GPCR das intrazelluläre G-Protein aktivieren.

GPCR und cAMP: Viele GPCRs beeinflussen die Aktivität der Adenylat-Cyclase -> Veränderung der Konzentration von cAMP. Um cAMP wieder abzubauen, wirkt das Enzym cAMP-Phosphodiesterase. Koffein hemmt diese beispielweise. cAMP aktiviert fast immer eine PKA (cAMP abhängige Proteinkinase). Wie Kinasen das so machen phosphorylisieren sie gern. Zum Beispiel bei Adrenalin als ersten Botenstoff die GlykogenPhosphorylase -> Glykogenabbau. Aber die PKA kann noch anderes…

1. Erläutere wie durch den cAMP Signalweg Gene in ihrer Transkription beeinflusst werden können.

2. Was ist eine Transaktivierungsdomäne?

   • Teil eines Transkriptionsfaktors

   • Teil eines Promotors

   • Damit bindet der TF an die DNA

3. Kann ein Transkriptionsfaktor ohne Transktivierungsdomäne die Transkription bewirken?

4. Kann man eine Transktivierungsdomöne mit einem anderen Transkriptionsfaktor koppeln?

VORLESUNGSFRAGE: was es sonst noch über CREB zu wissen gibt.

Okay also nochmal zu CREB.

CRE = cAMP-response Element = CREB bindendes Element, also der Teil auf der DNA, an dem CREB bindet.

CREB = CRE-Binde-Protein also das Protein, das dann an CRE bindet

CBP = CREB-Bindendes Protein, also das Protein, dass CREB braucht um zu funktionieren.

also heißt CBP eigentlich cAMP-response-Element-Bindeprotein-bindendes Protein.

Schachtelteufel nennt man das. Egal.

Wenn du mal auf den orangenen Teil der Skizze siehst also auf aktiviertes Ziel-Gen, stellt sich die Frage - welches Zielgen denn so?

1. Welche Signalwege wirken über CREB?

   
   

Wir haben also gerade gelernt dass CREB als Transkriptionsfaktor durch mehrere Signalwege wirkt. Auf diesem Bild kannst du sehen, dass CREB in seiner Transaktivierungsdomäne viele Phosphorylierungsstellen hat.

Die Phosphorylierungsstellen sind gut, die bedeuten nämlich, dass CREB schnell Kontakt zu CRE aufnehmen kann.

Phosphoryliertes CREB bindet nämlich an CBP.

Auf dem Bild kann man außerdem sehr schön sehen, dass wir ja irgendwie auch schon gelernt haben in einer Mentimeterfrage, was die Transaktivierungsdomäne neben aktivieren noch so tut: nämlich an den Präinitationskomplex zu binden. Das wirkt ja schon sehr Transkriptionsfördernd. ABER die tausend-pence-Frage:

1. Was für eine Auswirkung hat den CBP auf die Transkription? Wahrscheinlich eine positive, aber WIESO?

VORLESUNGSFRAGE: The story about NFAT

(NFAT ist wichtig zu kennen, wird aber weder in einer Prüfungsfrage noch in einer Übungsfrage erwähnt)

Okay. Der Weg von NFAT zur DNA ist lang.

Wir teilen ihn in drei Schritte:

• Ca2+ Freisetzung am ER

• Aktivierung von NFAT

• Translokation von NFAT in Zellkern.

Los gehts.

Ein B-Zell-Rezeptor wird stimuliert (ein T-Zell-Rezeptor auch, aber da läuft das parallell genauso und gleichzeitig bisschen anders) Also ein B-Zell-Rezeptor wird stimuliert und aktiviert Tyrosin-Kinasen, in diesem Fall eine namens Syk und Btk. Diese phosphorylieren BLNK und das wandert dann an die Membran. An BLNK ist ein weiteres Protein gebunden, das mitwandert und das heißt…

1. Wie heißt das Protein, dass an BLNK bindet?

   a. PIP

   b. PLC gamma

   c. ILK

   
   

   Cooli. Genau. Dieses Protein namens Phospholipase C macht was schrecklich kompliziertes und zwar spaltet es

1. PIP2 in….

a. PI3

b. IP1 und DAG

c. IP3 und DAG

Jawoll. Besagtes Molekül bindet ans ER und führt so zur Ca2+ Ausschüttung. Ca2+ sorgt nun dafür dass die entscheidende Phosphatase aktiviert werden kann, sie heißt….

1. Die Phosphatase, welche NFAT aktiviert, heißt:

a. Calmodulin

b. Calceurin

c. Calcineurin

d. Calcineurin und Calmodulin in Kombination

Korrekt. Diese Phosphatase kann gehemmt werden.

1. Nenne einen prominenten Vertreter, welcher Calcineurin hemmt.

Im Anschluss kann das DEphosphorylierte NFAT in den Zellkern einwandern und an die DNA binden. Für NFAT wurden mehrere Bindestellen im Promotor entdeckt.

1. CsA ist ein Hemmer von Calcineurin. Es wird auch als Therapeutikum gegeben. Folglich bewirkt es…. ?

(ich hlre auf bei Nietschke GLV 2 S.9)

ZUSAMMENFASSUNG NFAT

Kurze Zusammenfassung für NFAT:

1. NFAT wird aktiviert durch….

a. Direkte Phosphorylierung durch die Kinase Syk

b. Durch Dephosphorylierung von der Phosphatase Calcineurin

d. Indirekt durch die Phosphorylierung durch Syk von BLNK und dessen Translakoation an die Zellmembran

1. NFAT aknn nicht aktiviert werden, wenn …

   a. Calmodulin Calcineurin hemmt

   b. Cyclosporin Calmodulin hemmt

   c. Cyclosporin Calcineurin hemmt

2. Für die Ca2+ Ausschüttung am ER ist verantwortlich…

a. Phospholipase C

b. NFAT selbst

c. PIP2

c. IP3

d. DAG

VORLESUNGSFRAGE/ KLAUSURFRAGE/ ÜBUNGSFRAGE 4: The Story about NF-kB

NFkB ist dir aus deiner BA bekannt. NFkb ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor, welcher durch Entzündunsreaktionen induziert wird.

Der Signalweg sieht wie folgt aus: NFkB ist ein Dimer bestehend aus p50 und p65:

Darum liegt eine Art Klammer, der Inhibitor IkB. Dieser löst sich, sobald er phosphoryliert wird. Dafür brauchen wir eine Kinase und die heißt:

Diese Kinase wird selbst phosphoryliert durch eine intrazelluläre Signalkaskade, nachdem ein Zytokin am Rezeptor erkannt wurde. So. Also diese Kinase phosphorliert unsere Klammer IkB.

Durch diese Phosphorylierung löst sich die Klammer von NFkB und wird im Anschluss mit einer Ubiquitinkette besetzt. Wir wissen ja alle was das heißt. RIP IkB.

ok genug der späße….

Also NFkB kann in den Zellkern wandern. Mit diesem Wissen ist es für uns kein Problem diese Mentimeter-Frage zu beantworten:

1. Der Transkriptionsfaktor NF kappa B wird….

   a. durch direkte Phosphorylierung aktiviert

   b. durch direkte Dephosphorylierung aktiviert

   c. durch Phosphorylierung und Abbau eines Inhibitors aktiviert

Im Skript folgen jetzt einige Beispiele von Paper wie NFkB genauer untersucht wurden. Die Conclusion ist folgende. Eines der Untereinheiten von NFkB hat eine Transaktivierungsdomäne und das andere nicht.

1. Welche UE von NFkB hat eine Transaktivierungsdomäne?

a. p50

b. p65

Weil NFkB so ein extrem wichtiger Transkritpionsfaktor ist verwundert es nicht, dass es eine große Regulierungsvariabilität gibt.

1. Nenne drei Möglichkeiten der Flexibilität von NFkB

Gerade der letzte Punkt, dass kB Bindestellen noch mit anderen Bindestellen kombiniert werden können, führt zu diesen schönen Bild:

Ein Transkritpionsfaktor kommt eben selten allein. Damit ist die Geschichte zu Ende. Halt. Es fehlt noch die wichtige Klausurfrage!!!

1. Beschreibe kurz den NFkB Signalweg und die NFkB abhängige Genregulation. (2020)

Das ist ebenso Übungsfrage Nr 4.

Das wars :)

VORLESUNGSFRAGE/ÜBUNGSFRAGE 5/KLAUSURFRAGE: Splicing

Ab hier geht es ums Splicing. Bei Splicing denk ich immer ans schweißen. Also, wir haben uns mit der Kontrolle zur Genexpression auf frühem Level intensiv beschäftigt. Wir haben gelernt wie Transkriptionsfaktoren Einfluss auf die Transkription nehmen, welche komplexe Pathways sie haben, wieviele Zielgene sie mitunter regulieren und wie flexibel diese Reaktionen ablaufen können. Wir haben auch gelernt, dass Transkriptionsfaktoren wie CREB, NFAT und NFkB nicht immer alleine agieren, dass es häufig Dimere sind, dass sie eine DNA-Bindedomäne und oft eine Transaktivierungsdomäne besitzen. Aber jetzt gehen wir einen Schritt weiter.

Die zweite Ebene der Expressionskontrolle, nachdem es zu einem RNA Transkript kam ist die RNA Processing Kontrolle, auch bekannt als RNA Splicing. Später werden wir uns noch Punkt Fünf widtmen - dem kontrollierten Abbau der mRNAs durch micro RNAs.

Hier zu sehen sind eine Säugetier und eine Hefe prä-mRNA sowie alle Nukleotidsequenzen die eine Rolle beim Entfernen eines Introns spielen. Dabei wissen wir die Nukleotide der RNA lauten:

A-U

G-C

R bedeutet nur Purin-Basen, also A oder G

Y bedeutet nur Pyrimidin-Basen, also U oder C

N heißt jedes Nukleotid.

Zu aller erst fällt auf, dass ein Exon und ein Intron immer ein AG dann ein GU trennt. Das reicht aber noch lange nicht um ein Exon vom Intron zu unterscheiden. Dieses Tetranukleotid (vier Basen) käme in einem 30 000 nt langen Intron 6x vor. Doof.

Es ist die Bildung eines Spleißosoms von Nöten. Dies nur kurz am Rande um es wieder ins Gedächtnis zu rufen.

1. Aus was besteht das Spleißosom?

a. mRNA und microRNA

b. snRNPs, smal nuklear RNAs mit Proteinkomponente

c. PolyASchwanz und tRNA

Ja genau, das sieht dann so aus:

Dabei bildet sich eine LAssostruktur an der prominenten Verzweigungsstelle des Adenin die oben abgebildet ist. Ihr vorran muss ein Purin, ein beliebiges Nukleotid, Cytosin, Uracil und eine PurinBase stehen, dann folgt das Adenin dann ein Cytosin. Braucht sich keiner merken. Ist nur ganz interessant, warum gibt es keine feste Abfolge?

Das Splicing kann flexibel erfolgen:

Auf dieser Grafik kannst du erkennen, wie unterschiedlich die Exons am Ende zusammengesetzt werden können und dementsprechend unterschiedliche Proteine codieren. Dieses System nutzt z.B. ein Eukaryot wie Hede nur selten (5 Prozent) Dem entgegen steht der Mensch (95 Prozent aller Gene werden alternativ angepasst/ alternatives splicing). Das sieht ungefähr so aus:

Das troponin T-Gen variiert hier zwischen Exon 3 und 4. Troponin-T ist ein Muskelprotein und besitzt mehrere Isoformen. Aber wer an alternatives Splicing denkt sollte vorallem an DSCAM aus Drosophila denken:

Dieses Gen kann 38016 verschiedene Proteine erzeugen. Spacig.

So und jetzt die wichtige Übungsfrage:

1. Nenne drei Mechanismen wie alternatives Splicing reguliert werden kann (Übungsfrage 5):

   Auch Klausurfrage 2008 (da war es aber auch nur nennen und nicht beschreiben)

So. Mut zur Lücke. Die genauere Beschreibung zu DSCAM lass ich jetzt mal aus

VORLESUNGSFRAGE/ÜBUNGSFRAGE 6 & 7/KLAUSURFRAGE:

micro RNAs (miRNAs)

Okay. Weiter gehts mit dem aller letzten Teil von Nietschke. Die mysteriösen microRNAs. Es war einmal ein Fadenwurm namens C.elegans und zwei Wissenschaftler die telefonierten über eine merkwürdige RNA namens lin4 welche das Protein lin14 runterregulierte. Spannend, interessierte aber keinen. Wie sich herausstellen sollte, regulieren diese kleinen microRNAs, wie lin4 eine ist, aber Tausende von Tier und Pflanzengenen.

(Alberts S. 309)

“Diese kurzen, regulatorischen RNAs kontrollieren die Genxpression, indem sie Basenpaarung mit bestimmten mRNAs eingehen und deren Stabilität und Translation kontrollieren”

Diese miRNA als Vorläufer wird bearbeitet und anschließend ins Zellplasma exportiert. Dort fügt es sich zu RISC zusammen - RNA induzierter Stilllegungskomplex. RISC wandert schließlich durch das Zellplasma auf der Suche nach einer mRNA die komplementär zu der miRNA ist. Findet RISC eine dieser armen mRNA-Seelen, so wird sie entweder sofort von einer beinhalteten Nuklease zerstört, oder die Translation wird abgebrochen oder die mRNA zu einem Bereich gebracht, in der andere Nukleasen sie zerlegen. Quasi wie Auftragskiller. Danach kann die miRNA im RISC Komplex weiterziehen und weitere mRNAs zerstören.

Wie eine miRNA nun gebildet wird und in den RISC-Komplex eingebunden wird, und ob sie die mRNA direkt zerlegt oder nur die Translation blockiert kommt jetzt:

Die Frage in Klausur und Übung lautet nun:

1. Wie werden micro RNAs gebildet? Wie werden sie prozessiert? Wie wirken sie in eukaryotischen Zellen? (2023, 2022)

   Auch Übungsfrage Nr. 6

2. Bzw. in Prüfung: Wie wirken mikroRNAs auf zelluläre mRNA? Zwei miRNAs mit unterschiedlicher Komplementarität, wie wirken sie auf mRNA? (2020, 2020 Sose, 2019)

1. Was würde mit einer Dicer knockout Maus passieren?

2. Was würde mit einer Maus passieren wo nur die B-Zellen einen Dicer knock out haben?

So! Und jetzt, da wir uns ausführlich mit dem endogenen Weg von miRNA beschäftigt haben, schauen wir uns eine Option an, wie Dicer mit exogener RNA (z.B. von Viren) umgeht.

Hier wird exogene dsRNA von Dicer in kleine siRNAs (small interferring RNA) geschnitten und in RISC eingebunden. Das ist ein Abwehrprozess in Pflanzen. Auch manche Würmer und Pilze machen das. Es kommt quasi ständnig zu einem perfect match, was zu einem Abbau entsprechender mRNA führt.

1. ÜBUNGSFRAGE 7: Wie kann man RNA-Interferenz als LAbormethode in menschlichen Zellen einsetzen?

notizkarte

• fokus nochmal auf CREB schau in ein lehrbuch

• b globin und LCRS nciht richztig verstanden

• RISC bei mi RNAs, wird miRNA immer in einen Komplex namens RISC eingebunden? oder ist der Komplex irgendwie immer ein andwerer? in der vorlesung ist es wirr im alberts steht nix