V12: Durchflusszytometrie

Gerät für zytologische Untersuchungen

• Kann Zusammensetzung einer Blutprobe bestimmen

Anfärben der Zellen mit fluoreszierenden Farbstoffen

Kann Eigenschaften bestimmen wie:

• Wie schnell teilen sich Zellen?

• Weisen Zellen bestimmte Tumormarker auf ihrer Oberfläche auf?

Zellproben gelangen in einem Flüssigkeitsstrom durch eine dünne Kapillare in das Zytometer

Durchtritt eines Partikels durch diese Kapillaröffnung erzeugt eine Widerstandsänderung (Impedanz (Wechselstromwiderstand, Coulter-Prinzip), proportional zu Größe und Partikelvolumen

Elektrische Registrierung von Zahl und Höhe dieser Impluse erlaubt die Zuordnung zu einer Blutzellpopulation

Bestimmung von Volumen und Größe der Zellen/Partikel

Partikel zwischen 0.4 - 50 um Größe

Blutzellen

Chromosomen

Algen

Protozoen

Mess-system für Partikel, die einzeln in einem Flüssigkeitsstrom (Hüllstrom) einen Laserstrahl passieren

Man nutzt eine Mantelflüssigekit, die den Zellstrom stabilisiert

FSC misst Größe

SSC die Granularität

Je größer eine Zelle und je mehr Strukturen in ihrem Inneren sind, desto größer ist das entstehende Streulicht

Streulichtmessung

Solange der Laserstrahl ungehindert durch die Flusszelle geht, entsteht kein Streulicht. Quert hingegen eine Zelle den Strahl, wird das Licht in verschiedenste Richtungen gestreut.

Gemessen wird das Streulicht an 2 Stellen:

• Vorwärtsstreulicht

  in Richtung des ursprünglichen Strahls

• Seitwärtsstreulicht

  etwa im 90Grad Winkel zum ursprünglichn Strahl

Hängt von Größe der Zelle ab

kleine Zellen verursachen ein kleines Licht, große Zellen ein großes Licht

Hängt neben der Größe auch vom Inhalt der Zelle ab

Finden sich viele Lysosome, Granula etc., hat man großes SSC

erfolgt nach dem Prinzip der Durchflussztyometrie (Hydrodynamische Fokussierung)

Parallel zur Messung von Erys, Häm und Thrombos

• mittels Streulicht, Impedanz

• alternativ bei einigen Geräten: Konduktivität (Leitfähigkeit), Fluoreszenz oder Zytochemie (Peroxidase)

> Differenzierung in Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Monozyten und Lymphozyten

Mit Hilfe spezieller Reagenzien werden die Zellmembranen perforiert, sodass die Färbelösung in die Zelle eindringen und Kern und Plasma anfärben

FSC und SSC kann Zell-Typen in einer heterogenen Zell-Population unterscheiden

Klassifizierung weiterer Untergruppen, wie z.B. die Einteilung der Lymphozyten in B-Zellen und T-Zellen erfolgt über die Analyse der Expression bestimmter Oberflächenantigene, den CD-AG

Sub-Klassifizierung erfolgt über die Bindung von fluoreszenz-markierten monoklonalen AK an spezifische CD-AG = Immunophänotypisierung

Clustder of Differentiation = CD

Zuordnungssystem der nur moAk erkannten Strukturen auf Blutzellen, in regelmäßig stattfindenden workshops definiert (CD1 - ca. CD338)

umfangreicher Werkzeugkasten zur Identifizierung von Blutzellen

Zwei Arten von Markern:

• Linienspezifische CD-Marker

• Differenzierungsstadien-spezifische CD-Marker

Je nach Bindung und Farbemission der gebundenen AK

Das Fluorchrom-Molekül absorbiert kurzfrsitig die Energie des Laserlichtes und wird hierdruch angeregt

Es gibt die energie in Form von

• Wärme

• Licht einer höheren Wellenlänge ab

Stroke Shift:

• Verschiebung der Wellenlänge bzw. der Frequenz von Licht (elektromagnetische Strahlung) zwischen Absorption und Emission

Das abgestrahlte Fluoreszenzlicht ist immer längerwelliger als das Anregungslicht

Abhängig vom Gerätetyp 4 - 30

Mehr Proben = mehr Infos, jedes Flurchrom erhöht die Aussage exponentiell

Erfordert Strom auf den Dynoden

Ist lichtempfindlich

Empfindlich gegenüber spezifischen Wellenlängen

Kann End- (wie gezeigt) oder Seitenfenster-PMTs sein

PMT`s sind farbenblind

multiplizieren die Photonen des einfallenden Lichts

Konvertieren Licht in ein elektronisches Signal

• Signal steigt und fällt mit der Menge des einfallenden lichts (0-10 Volts)

Höhe des Signals wird über die an der PMT angelegte Spannung kontrolliert

Präperation

• Ficoll vs. Lyse

• Wash / no Wash

• Antikoagluanzien

Fluorchrome

• bis zu 20 Farben

• Konjugate

• Isotypenkontrolle

• Kompensation

Gating

• Immunologisches Gating

• Lebend/Tot-Diskriminierung

• Dublettendiskriminierung

Absolutzahl Zellen/uL: Dual vs. Single-Platform

Zytometer

• Spezifikationen (laser, Filter…)

• Überprüfen der Laser und Fluidik

Regularien

• GLP, Akkreditierung, Zertifizierung

• Studien-/Prüfpläne

• Abrechnungsmöglochkeiten

Antikoagulanzien

• Ammonium-Heparin am stabilsten

• EDTA: Absatz binnen 12 h

• Citrat: kann Oberflächenmarker angreifen

Lyse

• Ammoniumchlorid ist nicht pH-stabil

• Jede Lyse andere Scattereigenschaften

• Fixierende Lysen sind stabiler. Cave: Lebend/Tot-Färbung

Zelaggregate

• Zellsiebe (40-70 um) verhindern ein Verstopfen des Zytometers

• Evtl. Zugabe von DNAse bzw. Kollagenase/Dispase

Gewaschen

• Besseres Signal-Rausch-Verhältnis

• Population sind besser darstellbar

• Geeignet für qualitative Untersuchungen

• Aber: Unspezifischer Zellverlust

• Nicht geeignet für Absolutzellzahl-Bestimmung

Ungewaschen

• Kein Zellverlust

• Geeignet für quantitative Untersuchungen

• Optimal für absolutzellzahl-Bestimmungen

• Am besten in Kombination mit pH-stabiler Lyse

Tote Zellen binden unspezifische AK und können so zu falsch-positiven ergebnissen führen

Ein immunologisches Gate ermöglicht oftmals eine bessere Abgrenzung der Zielpopulation als reines Scattergate

Autofluoreszenz

Unspezifische AK-Bindung

Spektrale Überlappung

Laser regen nicht nur Fluorcrhome an, sondern auch Substanzen in der Zelle z.B. Flavine, Lipide etc.

Je komplexer die Zelle, desto größer ist die Eigenfluoreszenz

Eigenfluoreszenz abhängig von der Anregungswellenlänge

negative Population im selbeln Röhrchen wie die Probe

Vorteil: identische Behandlung von Negativpopulation und Zielzellen

kann oftmals eine zusätzliche Isotypenkontrolle überflüssig machen

Kombiniert Autofluoreszenz und unspezfische Bindung

Analyse des unspezifischen Hintergrundes (Blank)

• Essentiell, wenn keine interne negative Population vorhanden ist

• Isotypen müssen an die selben Fluorchrome gekoppelt sein

• Vorteil: Berechnung des relativen anstiegs der Fluoreszenzitensität

Kontrolle erfolgt mit Einzelfärbungen für jedes verwendete Fluorchrom

Es sollten helle Signale verwendet werden

Da optische Filter nicht alle spektrale Überschneidungen der einzelnen Fluorchrome beseitigen können, ist eine elektronische Substraktion, die sog. spektrale Kompensation nötig, um diese Fluoreszenzen zu entfernen. Kompensation immer abhängig von den Verstärkereinstellungen.

Durchflusszytometrische Messung von FITC- und PR-markierten Beads (ohne Kompensation)

FITC Emission ist auch bei derjenigen WL hoch, bei der das PE-Signal gemessen wird. Deshalb erscheinen die FITC-beads als falsch positiv für PE-Markierung

Durch die elektronische Kompensation erscheinen die PE-markierten beads nur als PE-markierten beads nur als PE-positiv und die FITC-markierten beads nur als FITC-positiv

Ultraschall Generator zerlegt Zellsuspension am ausgang der Düse in einzelne Tröpfchen (nur eine Zelle pro Tropfen)

Bevor Suspension Düse erreicht, wird Fluoreszeztest gemacht

Fluorchromhaltige Zelle passiert das Messfnester, Fluoreszenzsignal gelangt zu Lichtdetektor (MT) und das gerät lädt Tropfen auf

Markierte Zellen reisen in geladenern Tropfen, unmarkierteZellen in ungeladenen tropfen, sodass die geladenen das elektrische Feld gelangen

Jede Zelle trifft auf mehrere Laserstrahlen

Je nach Größe und Beschaffenheit der Zelle (auch Aufnahme von Farbstoffen) wird das Laserlicht unterschieldich stark gestreut

Computer wertet aus

können fluoreszenzitensität von zellen messen, die vorher automatisch verdünnt und angeräbt werden

Messgröße reflektiert den Nukleinsäuregehalt der Zellen

Aufwändiges System mit behandelten Zellen, Photomultiplier detektiert auch schwache Signale und kann elektronische Signale umwandel bzw. verstärken

Fluoreszenzitensität der RNA und DNA des Kerns und zytoplasmatische Zellorganellen ermöglichen Analyse des SSC eine Differenzierung der normalen Zellklassen sowie eine Quantifizierung der unreifen Granulozyten

Aktivierte B-Zellen liefern durch hohen RNA-Gehalt der Ribosomen besonders hohe Fluoreszenzsignale udn bilden seperate Lymphozytenpopulation

Pappenheimer Färbung nicht möglich

Zytochemische Färbung und Nachweis der CD-AG

Alkalische Leukozytenphosphatase-Färbung (ALP, LAP,NAP)

• Alkalische Leukozytenphosphatase bei CML vermindert (<10) bei Entzündungen erhöht (>110)

Alpha-Napthylazetat-esterase (unspezifische esterase)-Färbung

• Esterase positiv. Wichtig ist, ob unreife Leukämiezellen (Blasten) einer AL positiv sind

PAS (Periodic-Acid-Schiff)-Färbung

• Grobkörnige PAS-positive (glycogenhaltige) Zelle bei ALL

(Myelo)-Peroxidase-Färbung (MPO)