Ayah Alt: Chromo + BC Versuche

• UV-Detektor (Single-Wavelength UV- Detektor):

  • misst die Lichtabsorption bei einer/ wenigen spezifischen Wellenlängen, die vorab eingestellt werden (z.B. 254 nm oder 280 nm)

  • Wellenlänge MUSS vor der Analyse ausgewählt werden, was die Flexibilität einschränkt.

  • Arbeitet mit einem Photodioden-Empfänger, der Licht einer einzigen Wellenlänge detektiert.

• DAD (Dioden-Array-Detektor):

  • misst die Absorption von Licht über einen breiten Spektralbereich gleichzeitig (z.B. 190 bis 800 nm)

  • besthet aus einer Reihe von Dioden, die simultan die Lichtintensität bei verschiedenen Wellenlängen erfassen

    -> es wird so ein ganzes Absorptionsspektrum der Substanz aufgenommen.

• chemische Eigenschaften bei FID- Detektor: Hitzestabil, brennbar, organisch

• Faktoren, die die Signalgröße beeinflussen:

  • Trägergas

  • Säulentemperatur

  • Länge der Säule: je länger, desto bessere Trennung

  • Anzahl der theoretischen Böden

  • Konzentration und Volumen der Probe

• a) Cyclodextrine = Glucosemoleküle, die mit Kieselsäure modifiziert sind

• b)

  • zur Trennung von Enantiomere und Kontrolle der optischen Reinheit

    -> Trennung von Steroiden

    -> eingesetzt als stationäre Phase

• um einen Extrakt in DCM zu untersuchen braucht man ein polares LM. Falsch

• um eine bessere Trennung eines polaren Stoffes zu erhalten, muss die Polarität des Fließmittels erniedrigt werden.Falsch

• Kieselgelplatten werden mit Mangan-haltigen Zinksilicat gemacht, was bei 366 nm leuchtet. Richtig

• bei einer RP-Platte ergeben unpolare Substanzen hohe Rf-Werte. Falsch

  -> sie werden damit zwar getestet aber ergeben KEINE hohen Rf- Werte.

• eine Kammersättigung führt zur Besserung der Auftrennung und höheren Rf- Werten. Richtig

• Kieselgel

• stationäre Phase bei GC, HPLC und DC

  -> chromatographische Auftrennung von Analyten

• verhindert das Verdampfen flüchtiger Fließmittelkomponenten -> damit die Zusammensetzung des Fließmittels sich nicht verändert.

• Bessere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse -> bessere Trennung

• unpolare stationäre Phase => modifiziertes Kieselgel

• mobile Phase ist polar

• wird in der Chromatographie zur Trennung von hydrophoben/unpolaren Analyten verwendet

• Bsp. C18-RP

• Signale kommen verzögert am Detektor an, aufgrund von schlechter Trennung

• kommt vor bei Analyten, die saure oder basische Eigenschaften besitzen

• kann vermieden werden,

  • indem Modifier hinzugegeben werden, sodass der Analyt undissoziiert vorliegt

  • Austauschen der Säule

  • frisches Laufmittel

  • Überladung der Probe vermeiden

  • Kammersättigung bei DC

• Ähnliche Polarität/ Eigenschaften wie die zu untersuchenden Substanzen aber andere Retentionszeit

• chemisch stabil

• darf keine Verunreinigungen enthalten, die die gleiche Retentionszeit wie die zu bestimmende Substanz aufweisen.

• a)

  • C-H-Bindung: mind. eine H- Bindung an C muss vorhanden sein

  • Flüchtigkeit: die Substanz muss in der Gasphase vorliegen, um in den FID injeziert zu werden.

• b)

  • mobile Phase zu viel bzw. nicht reguliert -> Trägergas

  • Säulentemperatur

  • Länge der Säule bzw. Anzahl der theoretischen Böden, je länger desto mehr theoretische Böden (bessere Trennung)

  • Konzentration der Substanz

• Fette

• Terpene (ätherische Öle)

• Öle

• Steroide

• UV/Vis

  • sofern Chromophor vorhanden

• DAD

  • Mehrkanalphotometer -> Messung mehrerer Wellenlängen gleichzeitig

    -> gesamtes Absorptionsspektrum des Analyten messbar

    -> schnelle Aussage über Identität und Reinheit

  !!! UV-CutOFF: zuverlässige Detektion des Analyten erst oberhalb des Cutoffs möglich.

• RI = Brechungsindexdetektor

  • Substanz ohne Chromophor (Zucker, Polyethylenglycole, Polymere)

• MS

  • extrem hohe Empfindlichkeit!

  • Massenspektren liefern zusätzliche Strukturinformation

  • hoher apparativer Aufwand zur Kopplung der Geräte

• Fließmittel = Träger des Stofftransports über die Sorptionsschicht (stationäre Phase)

• Elutionskraft = Maß für die Fähigkeit des Fließmittels Probenmoleküle in der mobilen Phase zu erhalten

  • Abhängig von einer Vielzahl von Faktoren (Polarität des LM und der stationären Phase, Löslichkeit der Analyten in der mobilen Phase, Temperatur, …)

• Elutrope Reihe = empirische Einordnung der LM nach Polarität

  • Abhängig von verwendeter stationärer Phase

• Cyclodextrine

  • bilden das Kernstück chiraler Kappilarsäuren

• ori = Origin of replcation, Replikationsursprung

• geringe Molekülmasse

• Polylinker = Restriktionsschnittstelle, die sich überlappen.

• autonome Replikation

• mindestens ein Selektionsmarker

• Die DNA- Fragmente wandern wegen der negativen Ladung des Phosphatesters vom (-) zum (+)- Pol. Die Wanderung der DNA- Fragmente ist in einem bestimmten Bereich proportional zum Logarithmus der Größe. Am weitesten wandern die kleinen DNA- Fragmente, da diese durch das Gel wenig Widerstand bekommen.

1. Adenosinmonophosphat

   -> bei DNA: Desoxyadenosinmonophosphat

• a) Phosphatrest- Zucker- Nukleinbase Adenin

• b) RNA (Ribonukleinsäure)

• a) Plasmit = Ring

  • BamHI: 1 Fragmente

  • EcoRI: 2 Fragmente

  • BamHI und EcoRI: 3 Fragmente

• b)

  • es bleibt ein Fragment, welches an 250 bp geschnitten worden ist. Das Fragment hat die volle Länge 4000 bp.

    -> Sonde ist normal radioaktiv markiert.

• Hind ist wirkungslos

• 2 und 5 kb

• 7,96 kb

• Fragment 1: 1,0 kb

• Fragment 2: 0,3 kb

• Fragment 3: 1,1 kb

• Fragnent 4: 1,6 kb

• Fragment 5: 0,8 kb

• Fragment 6: 1,2 kb

• Abb von blunt (stumpf) und sticky (klebrig) ends

-> Restriktionsschnittstellen

• sticky ends = versetzte Schnittstellen

• blunt ends = gerade Schnittstellen

• Restriktionsenzyme sind Lyasen

-> Falsch: Restriktionsenzyme sind Hydrolasen, keine Lyasen (diese hinterlassen DB). Sie schneiden die DNA an spezifischen Erkennungssequenzen.

• Restriktionsenzyme können nur im Polylinker von Plasmiden schneiden.

-> Falsch: Restriktionsenzyme können jede Erkennungssequenz schneiden, unabhäng davon, ob sie sich im Polylinker eines Plasmids oder woanders befindet.

• Restriktionsenzyme sind hitzeempfindlich

-> Wahr: die meisten Restriktionsenzyme stammen aus Bakterien und denaturieren bei hohen Temperaturen, da sie nicht aus Hitzestabilen Bakterien stammen, sondern aus normalen Bakterien.

-> außer die Taq- Polymerase

• taq-Polymerase ist ein Restriktionenzym.

-> Falsch: Taq-Polymerase ist eine thermostabile DNA- Polymerase, die in der PCR verwendet wird. Sie sind keine Restriktionsenzyme.

• genomische DNA besitzt keine Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme.

-> Falsch: genomische DNA kann Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme enthalten, da diese auf spezifische Basensequenzen basieren, die überall in der DNA vorkommen können.

• Restriktionsenzyme schneiden die WBB (H-Brückenbindungen) zwischen den Basenpaare.

-> Falsch: Restriktionsenzyme schneiden zwischen den Basenpaaren entlang der Phosphordiesterbindungen und trennen somit die DNA-Stränge.

• 2. nur Doppelstrang

• 4. keine Klammer, ist vollkommen ok

• 5. so wie es da steht

11.

• Plasmide sind üblicherweise bei Prokaryoten vorhanden aber auch vereinzelt bei Eukaryoten -> Wahr

  • in der Backhefe

• Die Konfiguration des Promotors kann über die Funktionalität eines Gens entscheiden. -> Wahr

• E.coli kann zur Überexpression bestimmter Proteine verwendet werden. -> Wahr

• Aliinase -> Lyase

• Catecholoxidase -> Oxidoreduktase

• Restriktionsenzyme -> Hydrolase

• Taq- Polymerase -> Polymerase

• Restriktionsenzyme können schneiden:

  • genomische DNA

  • Plasmid DNA

• a) DNA-Vorlage:

  • Template

  • enthält die zu vervielfältigende Sequenz

• Primer:

  • kurze, einzelsträngige DNA- Stücke, die spezifisch an die Zielsequenz binden.

• DNA- Polymerase:

  • ein Enzym, das die DNA synthetisiert (z.B. Taq-Polymerase)

• dNTPs:

  • desoxynukleosidtriphosphat

  • die Bausteine für die DNA-Synthese

• Puffersysteme:

  • stellen die optimale Umgebung für die DNA- Polymerase

  • inklusive Mg2+- Ionen

• b) PCR- Zyklus

  • Denaturierung (95°C)

  • Annelierung (58/55°C)

  • Elongation (72°C)

• c) T des zweiten Schritts ist abhängig von

  • T ist Primerabhängig, je nachdem welcher Primer verwendet wird

  • T richtet sich nach der Zusammensetzung und Länge des Primers

• a) mit PCR und isothermaler DNA-Amplifikation kann doppelstrangige DNA vervielfachte werden.

  • PCR

  • oder expression mit E.coli Bakterien, nach vollendung der Aufgaben, tötet man Bakterien. (= isothermale DNA- Amplifikation)

• b)

  • bei der isothermalen Amplifikation wird EINE Temperatur verwendet. Keine Zyklen mit unterschiedlicher T nötig.

• Enzym für PCR muss:

  • hitzestabil sein, damit die Aktivität nicht beeinträchtigt wird.

• Midori Green wird zum Anfärben der DNA im Gel benutzt

  -> Richtig

• Ethidiumbromid interagiert mit Peptidbindungen

  -> Falsch (zwischen BP =Interkalationsverbindung)

• Bromphenolblau erhöht die Dichte der Probe

  -> Falsch

• Supercoiled und opencircle DNA werden durch Restriktionsenzyme hervorgerufen

  -> Falsch

• Können Plasmide und DNA in einer Zelle gleichzeitig vorkommen.

  -> Richtig

• Da sich EtBr mit DNA verbindet, ändert sich so seine Absorption => interkaliert

  • lagert sich ein

• dadurch erscheinen diese Stellen als helle Banden unter UV-Licht.

• Bromphenolblau färbt die DNA- Banden an.

  -> Falsch: Bromphenolblau ist ein Lauffarbstoff, der zur Sichtbarmachung der Probenmigration während der Elektrophorese dient, färbt aber nicht die DNA Banden.

• Glycerol ermöglicht das Einpipettieren in die Probentaschen.

  -> Richtig

• Ethidiumbromid interkaliert in den DNA- Strang

  -> Richtig

• Auf einem nativen Agarosegel läuft ein Plasmid immer weiter als Fragmente einer genomischen DNA.

  -> Falsch

• Auf einem nativen Agarosegel wandert DNA vom positiven zum negativen Pol.

  -> Falsch

• nach Laufen der Elektrophorese werden die Banden auf einem Agarosegel mit Comassie-Brilliantblau angefärbt.

  -> Falsch (Proteinen nicht für DNA)

• RNA kann auf einem Agarosegel mit Ethidiumbromid angefärbt werden.

  -> Richtig

• ein linearisiertes Plasmid, mit EcoRI und HindIII geschnitten, ist als gamma- Standard verwendbar

  -> Falsch, gamma- Standard besteht aus DNA des gamma- Phagen

• auf einem nativen Agarosegel können Cosmide analysiert werden.

  -> Richtig

• a) Porengröße

  • Sammelgel hat größere Poren und Trenngel ist feinporig

• pH- Wert:

  • Sammelgel geringerer pH (ca. 2 Einheiten geringer)

  • Trenngel ist alkalisch

• b)

  • SDS = Na-dodecylsulfat

  • beta-Mercaptoethanol

• Zellwand-Lyse

  -> Lysozym

• Auflösung der Cytoplasmamembran

  -> SDS- Extraktionspuffer

• Ausfällung von Proteinen und Proteinbestandteilen

  -> Na-Acetat/Phenol/Chloroform

• Präzipitation der DNA

  -> Ethanol, T= -20°C oder Isopropanol bei Raumtemperatur

• SDS (Na-Dodecylsulfat)

• beta- Mercaptoethanol

• Hitze (100°C)

• Harnstoff

• DTT (Dithiothreitol)

  
  

• BCIP ist das Substrat der alkalischen Phosphatase.

  -> Richtig

• Bei der SDS- Page kann zur Denaturierung der DNA auf der Membran SDS und Hitze genutzt werden

  -> Falsch, SDS ist zur Trennung von Proteinen

• die endgültige Hybridisierung wird bei mind. 80°C durchgeführt

  -> Falsch, meistens bei 37- 68°C

• das behandeln mit Vorhybridisierungslösung dient der Absättigung von ungesättigten Bindungstellen.

  -> Richtig

• das Backen dient der Denaturierung der DNA.

  -> Falsch, Backen dient der Fixierung auf einer Membran

• Die SDS-PAGE ist das gewählte Verfahren zur Analyse von Plasmiden

  -> Falsch, SDS- Page dient der Trennung von Proteinen

• Southern Blot = Nachweismethode, die das Vorkommen eines Gens in Genomen untersucht.

• dabei wird das Gen aus Organismus 1 als DNA- Sonde mit der DNA von Org. 2 hybridisiert.

• die ausgelöste Reaktion der Sonde ist detektierbar und weist eine Ähnlichkeit/ Homologie auf.

• Markierung der DNA- Fragmente mit Digoxygenin => DNA-Sonde

• AK (Antikörper) binden an das Digoxygenin

  • die AK tragen alkalische Phosphatase als Enzym zur Detektionsreaktion

• stattgefundene Hybridisierung deutet darauf hin, dass Gensequenzen beider Org. 1 und 2 komplementär zu ihren heterologen Sonden sind.

• Membran bei 120°C zwischen 2 Filtern im TK (Trockenschrank) trocknen.

  -> Fixierung der DNA auf die Membran

• Membran wird mit Hybridisierungslösung angefeuchtet

• Membran wird auf Hybridisierungsstab aufgewickelt und in Hybridisierungsröhre gegeben.

• Röhre wird mit Hybridisierungslösung befüllt und 1h in einem 37°C temperierten Wasserbad inkubiert.

• Digoxygenin

• über den Linker an DNA gekoppelt

• Aglykon

• b) alle ???

• Zugabe Anti-Digoxygenin-AK gekoppelt mit alkalischen Phosphat

• Dephosphorylierung der ersten Substratkomponente BCIP

• Redoxreaktion unter Beteiligung der 2. Substratkomponente NBT -> Entstehung von Farbstoffen

• Naturstoffklasse: Phytosterole

• Name: Digitoxigenin, Vorkommen in Digitalis purpurae

• SDS =Nadodecylsulfat

  • zur Denaturierung von Proteinen

• Biuret- Komplex = Kupfer- Tartrat-Lösung zur Proteinkonzentrationsbestimmung

• Christian-Warburg: bei 2 Wellenlängen, 260 nm und 280 nm. Ist eine ungenaue Methode.

• Bradford: Kolorimetrisch, bei 595 nm. Verdünnungsreihe mit BSA- Standard.

  • Mit Kalibirergerade wird die Konzentration berechnet.

• Biuret: Bildung eines Farbstoffkomplexes (blauviolett) zwischen Peptidbindungen und Kupfer-II-Ionen.

• die SDS-Page ist ein natives Analytik- Verfahren.

  -> Falsch: SDS- Page ist ein denaturierendes Verfahren

• Für den Erfolg der SDS- Page darf nicht gekocht werden.

  -> Falsch: das Kochen (ca. 95°C) dient der vollständigen denaturierung der Proteine.

• DNA wandert vom Plus- zum Minuspol

  -> Falsch

• Bei der Bradford- Methode erfolgt die Auswertung anhand einer Geradengleichung.

  -> Richtig

• Bei Warburg und Christian wird die Absorption bei 2 Wellenlängen im sichtbaren Bereich gemessen.

  -> Falsch: UV- Bereich!

• Membran-/ Strukturlipide

  -> Phospholipide und Glykoside

• Speicherlipide

  -> Triacylglycerin

• a) Transformation = kontaktlose Aufnahme von freier DNA in Bakterien

• b)

  • Temperatur

  • Kompetenzgrad:

    • optimale Inkubationszeit nach CaCl2- Behandlung

  • eingesetzte DNA- Menge

  • Plasmidgröße:

    • Transformationsrate nimmt mit zunehmender Plasmidgröße stark ab

  • DNA- Struktur:

    • supercoloid DNA zeigt höhere Anzahl an Transformationen als open- circular DNA und lineare- DNA

• Transformation = Aufnahme von freier DNA (PLasmide) in ein Bakterium/ eukaryotische Zelle

• Transduktion = Gentransfer durch Viren/Phagen in eine eukaryotische/ prokaryotische Zelle

• Konjugation = Übertragung von Teilen des Genoms von einer Spenderzelle auf Empfängerzelle

• Prinzip:

  • 1. Vektor mit LacZ-Gen: der verwendete Plasmidvektor enthält das lacZ-Gen, das für die beta-Galactosidase kodiert. Dieses Enzym spaltet Substrate wie X-Gal und führt zur Bildung eines blauen Farbstoffs.

  • 2. Multiple Cloning Site (MCS): Innerhalb des lacZ-Gens befindet sich eine Multiple Cloning Site (MCS), wo Fremd-DNA eingefügt werden kann. Wird ein DNA- Fragment in diese Region eingefügt, unterbricht dies das lacZ-Gen und inaktiviert die Produktion der beta-Galactosidase.

  • 3. Transformation: Bakterien werden mit dem rekombinanten Vektor transformiert und auf einem Agar- Nährmedium ausgestrichen. Das enthält:

    -> X-Gal (Substrat der beta-Galactosidase)

  • 4. Farbbildung:

    -> nicht- Rekombinante Klone (Plasmid ohne eingefügte Fremd- DNA) produzieren funktionale beta-Galactosidase, die X-Gal spaltet. Diese Kolonien erscheinen blau.

    -> Rekombinante Klone (Plasmid mit eingefügter Fremd-DNA): das lacZ-Gen ist inaktiviert, keine beta-Galactosidase wird produziert. Diese Kolonien erscheinen weiß.

• a) Gen: LacZ; Enzym: beta- Galactosidase

• b)

  • keine klonierte DNA => blaue Kolonien

    -> lacZ Gen ist aktiv, enthalten Galactosidase. Wachsende Bakterien stellen blauen Farbstoff her.

  • klonierte DNA im Vektor vorhanden => farblose Kolonien

    -> lacZ Gen ist INaktiv, da der Leserahmen des alpha- Fragments unterbrochen ist.

    -> Bakterien und Plasmide können keinen blauen Farbstoff herstellen.

• zur Kompetentmachung von E.coli-XL1-blue für die Transformation von pUC19 wird im Praktikum Hitzeschock verwendet. Die angezüchteten Bakterien werden in der log-Phase entnommen und ausplattiert. Zu beachten ist auch die Generationszeit von 20 min. Für den Erfolg der Transformation entscheident ist außerdem, dass die gepickten Klone nach dem Bebrüten der Platte mit Calciumchlorid behandelt werden. Alternativ kann als physikalische Transformationsmethode die Elektroporation verwendet werden.

• a)

  • es handelt sich um ein zyklisches Depsipeptid

  • es wird durch Bakterien gebildet und aus Ardisia crenata isoliert

• b)

  • hemmt Gq Protien relativ spezifisch und zelltypenunabhängig durch Konformationsänderung , indem es an die alpha- Domäne bindet und ihre Konformation ändert.

  • Dissoziation der Untereinheiten alpha-, beta-, und gamma wird verhindert

  • Signaltransduktion der Gq Proteine wird dadurch verhindert (keine Signalweiterleitung)

• c)

  • vasolaxierende Wirkung -> Durchblutung wird erhöht

  • bei Atemwegserkrankungen (Asthma, Angina pectoris): Relaxion der glatten Muskulatur

  • Hemmung der Zellwachstums in Melanomzellen, Hemmung von Melanomzellmigration -> Zytostatikum

  • dient als Fraßschutz für die Pflanze Ardisia Crenata

• Candidatus Burkholderia crenata ist ein symbiotisches Bakterium. Es befindet sich in den Blattknoten von Ardisia crenata. Diese gehört zur Familie der Primulaceae C. Burkholderia crenata produziert FR900359, was chemisch gesehen ein zyklisches Depsipeptid ist. Das besondere ist die FR900359 Biosynthese.

• cyclisches Depsipeptid

• Ardisia Crenata (Pflanze)

• Bakterien tragen zur Biosynthese bei

• E. coli und Candidatus Burkholderia crenata

• Bakterien z.B. E.coli

  -> Produktion großer Mengen an Insulin

• Hefe z.B. Saccharomyces cerevisiae

  -> Produktion großer Mengen an Insulin

• B-Lymphozyten aus Milz immunisierter Mäuse

  -> Produktion großer Mengen spezifischer AK