Alt-K. 19-20-21

Lysozym:

= Muramidase

• Lysozym kann die Zellwand von Bakterien auflösen.

• hydrolysiert glykosidische Bindungen (Lysozym wirkt auch als Glykosidase, da Glykosidase ein Enzym ist) und zerstört die bakterielle Zellwand -> die Mucopolysaccharide

  -> dabei werden die beta-1,4-glykosidischen Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure (MurNAc) und N-Acetylglucosamin (GlcNAc) gespalten.

• gehört zu den Hydrolasen = beschleunigt die hydrolytische Spaltung

Praktikum:

• Reinheit:

  • man nimmt das abgetrennt Protein. Dieses wird mit SDS-Gelelektroporese (Na-Dodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) gereinigt. Erkennt man mehrere angefärbte Banden, so ist das Protein noch nicht gereinigt. Bei nur noch einer Bande, ist das Protein rein.

• Ausbeute und Konzentration/Gehalt:

  • Proteinkonz. der einzhelnen Konzentrationen durch die Bradford-Methode mit Coomassie Brilliant Blue G-250

  • durch die bestimmten Proteinkonz. kann der Anteil an Lysozym im Gesamteiweiß errechnet und die Ausbeute angegeben werden.

• Aktivitätstest:

  • wird photometrisch durchgeführt

Alternative?

-> ELISA (Versuch 3)

-> Aminosäureanalyse nach Totalhydrolyse (Versuch 4)

Quelle: V01 Protokoll

Glykogensynthese läuft über 4 enzymatische Stationen:

-> Synthese von Glykogen im Cytosol

• Ausgangspunkt: durch Hexokinase (Muskel und Leber) oder Glucokinase (nur Leber) aus freier Glucose Glucose-6-phosphat gebildet

  • ATP -> ADP

• Isomerisierung: durch Glucosephosphat-Mutase zu (isomeren) Glucose-1-phosphat

  • zunächst die Phosphatgruppe von einem phosphorylierten Serylrest im aktiven Zentrum des Enzyms auf das Substrat übertragen. Entstandene Intermediat Glucose-1,6-bisphosphat gibt die C6-Phosphatgruppe wieder an den Serylrest ab.

• mit UDP-Glucose-Pyrophosphorylase zu UDP-Glucose

  • UTP -> PPi (= 2Pi)

  • es muss eine aktivierte Form der Glucose entstehen, dafür verknüpft das Enzym den Phosphatrest mit dem alpha-Phosphatrest von UTP. Die beta- und gamma- Phosphatgruppen werden als Pyrophosphat abgespalten.

  • Produkt: UDP-Glucose besitzt eine glykosidische Phosphoesterbindung mit hohem Gruppenübertragungspot. => aktive Bindung

-> bis hier reversibel

• durch Glykogen-Synthase wird Glykogen (n Glucose) mit UDP-Verbrauch zur verlängerten Glykogenkette (n+1 Glucose)

  • Irreversibel erst durch diese Hydrolyse von Pyrophosphat durch Pyrophosphatase

Komplex 5:

• Zahl der Untereinheiten: 16

  • davon mitochondrial codiert: 2

• Funktion: Rückfluss von Protonen; ATP-Synthese

• d= 10 nm

• der kleinste und effizienteste Motor mit Wirkungsgrad von nahezu 100%

Nano-Rotationsmotor synthetisiert ATP:

• Komplex V = ATP-Synthase

  -> ist das Schlüsselenzym der mitochondrialen Energiegewinnung

  • ist ein großer Membranständiger Proteinkomplex (>500 kd)

• besteht aus 2 Segmenten: F1-Teil und F0-Teil

-> F1-Teil:

• an dem läuft die ATP-Synthese ab

• ragt kugelförmig in den Matrixraum hinein

• besteht aus 5 Untereinheiten

  • alpha-3, beta-3, gamma, delta und epsilon

-> F0-Teil:

• O = Hemmstoff Oligomycin

• ist in die innere Mitochondirenmembran integriert

• besteht aus 11 Untereinheiten

  • davon bilden alpha-1 und c-10 einen zentralen Protonenkanal

  • beta-2 OSCP1 (oligomycin sensitivity conferring protein) verbindet F1 mit F0

-> Ablauf:

• Fließen H+ an einem kritischen Aspartatrest der c-UE vorbei, so lösen sie eine Drehbewegung des c10-Rings (F0) in der mitochondrialen Membran aus

  -> zusammen mit Matrixseitiger gamma-delta-epsilon-UE von F1 bildet dieser Ring den Rotor

  -> Stator = assymetrisch befestigten UE alpha, beta und OSCP

  • verhindern das Mitdrehen des alpha3-beta-3-Hexamers

• Energie zur ATP-Synthese kommt durch: Rotation der konisch zulaufenden gamma-UE im Zentrum des alpha3-beta-3-Hexamers, die periodisch Konformationsänderungen in den kat.-Zentren an den Grenzflächen der 3 alpha-beta-Dimere bewirken.

-> ATP-Synthese:

• ATP-Synthaseaktivität von F1 kat. die stark endergone Synthese von ATP aus Pi + ADP

  • wird angetrieben durch H+-motorische Kraft des H+-Gradienten über die innere mitochondriale Membran

-> chemische Reaktion zur mechanischen:

• durch die mit der Drehbewegung des gamma-Motors eingehende Konformationsänderungen der beta-UE werden fest gebundenes neu synthetisiertes ATP aus seiner Bindungstasche herausgedrückt

  ->0-Zustand

• zweite Konformation schließt H2O aus der Bindungstasche des aktiven Zentrums aus und begünstigt Bildung von Phosphorsäureanhydridbindung zwischen ADP + Pi

  -> L-Zustand (die zweite Konformation)

• dritte Konformation hat viel höhere Affinität für ATP als für ADP + Pi, daher senkt die Gleichgewichtskonstante der Reaktion auf nahezu 1 -> Substrate + Produkte liegen unter Standardbedingungen nahezu äquimolar vor

  -> T-Zustand (dritte Konformation)

=> Proteinumgebung des aktiven Zentrums zahlt energetischen Preis für die Synthese, der dann durch mechanisches Aufbrechen der WW zu Produkt der Reaktion “rückerstattet” wird

=> durch strikte Kooperativität zwischen aktiven Zentren von F1 verhindert einen Leerlauf des Systems bei niedriger ADP-Konzentration

Klonierung von DNA mit PCR:

• PCR = Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

  • ist die einfachste Art, spezifische DNA- Segmente zu vervielfältigen

• Voraussetzung:

  • Teile der interessierten DNA-Sequenz muss bekannt sein

-> Verlauf:

• durch Sequenzinformationen werden 2 DNA-Oligonucleotide von je 15-20 Resten synthetisiert, die jeweils an einen der beiden komplementären Stränge hybridisiert und dabei exakt die DNA-Region begrenzen, die amplifiziert werden soll.

• 1. Denaturierung:

  • Reaktionsgemisch auf 95°C erhitzt

• 2. Annealing:

  • Abkühlen auf 55°C

  • Primer binden an die komplementären Einzelstränge und dienen als Starter für die DNA-Polymerasereaktion

• 3. Polymerasekettenreaktion

  • Synthese in 5`->3`Richtung, entlang der einzelnen Matrizenstränge

Also:

• durch kurzzeitiges Erhitzen (95°C) wird Initialreaktion unterbrochen, die neu gebildetetn Doppelstränge denaturieren

• bei T-reduktion (55°C) können große molare überschüssige Primer mit jeweils 2 Strängen (Eltern- und Tochterstrang) hybridisieren

• in der zweiten Runde synthetisiert DNA- Polymerase 4 Einzelstränge

-> Denaturierung, Annealing und Polymerase wiederholen sich so lange, bis 20-30 Reaktionszyklen zuende sind => DNA-Segment, das durch Lage der 2 Primer definiert wird, millionen- milliardenfach ampliziert wurde

Problem:

• PCR sehr anfällig für kontaminierende DNA

Proteasen:

• Unterteilt in: Endopeptidasen und Exopeptidasen

  • Endopeptidasen spalten innerhalb einer Polypeptidkette

  • Exopeptidasen an ihren Flanken

• 4 Hauptfamilien von Proteasen:

  -> Unterscheidung durch Katalysemechanismus

  • Serinproteasen (Trypsin)

  • Aspartatproteasen (HIV-Protease)

  • Cysteinprotease (Caspasen)

  • Metalloproteasen (ACE =Angiotensin- konvertierendes Enzym)

• Enzymklasse “Serinprotease”:

  -> kat- Reste: Ser, His, Asp

  -> typische Vertreter:

  • Verdauung:Trypsin, Chymotrypsin, Elastase

  • Blutgerinnung: Thrombin, Plasmin, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor VII

  • Enzyme der Komplementsysteme: C1r, C1s, C2b, Bb, D

• nicht alle Proteasen arbeiten nach dem molekularen Muster der Serinproteasen

Trypsin = Serinprotease/ Hydrolyase:

• proteolytische Aktivität von Trypsin (Serinendopeptidase) => Pankreasenzym

• katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen innerhalb eines Polypeptids

• dabei entstehen Oligopeptide unterschiedlicher Länge

Spezifitätstaschen von Serinprotease:

• basischer Rest von Trypsin (Seitenkette) bestimmt die spezifität des Enzyms

• Trypsin spaltet hinter basischen AS-Resten

Katalysemechanismus von Trypsin:

• aktives Zentrum von Trypsin ist Ser195

• Ser195 startet nucleophilen Angriff auf Peptidbindung und transferiert sein Proton auf das benachbarte His57. Positiver Überschuss im Imidazolring von His57 wird dadurch mit negativ geladener Seitenkette von Asp102 kompensiert.

• tetraedrischer Übergangszustand:

  -> das C-Atom der Peptidbindung nimmt eine tetraedrische Geometrie ein. Im Übergangszustand besitzt der negativ geladene Carbonylsauerstoff das Oxyanion-Loch und bildet 2 H-Brücken mit dem Peptidrückgrad des Enzyms

• Acylierungsphase der Proteolyse:

  -> der aminoterminale Teil ist kovalent als Ester mit dem Enzym verbunden. Freigesetztes Fragment = dem carboxyterminalen Teil des Substrats, der über einen neu entstandenen freien Aminoterminus verfügt => Aminokomponente

• Decylierungsphase der Proteolyse:

  -> nucleophile Angriff von Wasser aus das Acyl-Enzym-Intermediat erzeugt einen weiteren tetraedrischen Übergangszustand. His57 unterstützt erst basenkat. diesen Angriff, dann säurekat. die Freisetzung der Acylkomponente. Freigesetztes Fragment = aminoterminalen ABschnitt des Substrats mit neu entstandenen Carboxyterminus => Acylkomponente

  -> bei der Trypsinkat. ist die terminale AS typischerweise ein Arginyl- oder Lysylrest

-> Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt eine einfache Enzymkinetik

• praktisch kann ein Enzym kinetisch bestimmt werden, durch messungen verschiedener Substratkonz. mit resultierender Reaktionsgeschwindigkeit => Substratverbrauch/ Produktzunahme pro Zeiteinheit

• dabei wird die Anfangsgeschwindigkeit V0 bestimmt

• dazu misst man die Reaktionsgeschwindigkeit in der Anfangsphase der Enzymreaktion

  • mit Annahme: in dieser kurzen Zeit ändert sich die Substratkonz. nur geringfügig, daher konstant bleibt.

=> die bei verschiedenen Substratkonz. gemessenen Anfangsgeschwindigkeiten werden graphisch zur Sättigungskurve ausgewertet.

• Graph = hyperbolishcer Kurvenverlauf. (bsp. O2- Bindungskurve des Myoglobins

• Anfangs:

  • geringe Substratkonz., es findet sich stets ein “freies” Enzym, dabei wird also jedes im aktiven Zentrum eintreffende Substratmolekül umgesetzt

  • Umsatzgeschwindigkeit steigt fast linear mit Substratkonz.

• dann Substratsättigung

  • Substratmoleküle treffen immer mehr auf Enzymmoleküle, die schon belegt sind.

  • Reaktionsgeschwindigkeit nähert sich Maximalgeschwindigkeit Vmax an => ist vom Enzym-Durchsatz vorgegeben

=> Michaelis-Menten-Komplex = Enzym mit Substrat bildet einen (allg.) reversiblen Komplex

• Aus KOmplex entsteht das Produkt, wobei jeder Teilschritt durch Geschwindigkeitskonstante charakterisiert ist.

  • k1 = Bildung bzw. k-1 = Zerfall von E + S

  • k2 = Bildung von Produkt und freiem Enzym E

-> Michaelis-Konstante Km

• Harnstoff mach Proteine kaputt

• Lactatdehydrogenase soll Lactat und Pyruvat ineinander umwandeln.

• 
  

• DNA- und Proteinsequenzen werden in internationalen Datenbanken (z.B. Genabank) gesammelt

• in der “Protein Data Bank” sind die Informationen zur 3D- STruktur von Proteinen abgelegt. In anderen datenbanken werden Proteine nach strukturellen Kriterien klassifiziert

tRNA: 214, 219, 316

= transfer-RNA

• etwa die Hälfte der Nucleotide einer tRNA bildet über intramolekulare Basenpaarung eine kleeblattförmige Struktur.

  • modifizierte Basen sind rot

• über weitere H-Brücken entsteht die hakenförmige Struktur der tRNA

-> transfer-Ribonucleinsäuren (tRNAs) besitzen kleeblattförmige Architektur und eine hakenförmige Raumstruktur.

• Die Anticodonschleife trägt ein Nucleotidtriplett, das komplementär zum Codon der mRNA ist.

• Die invariante, ungepaarte CCA-Sequenz am 3’-En

• de eines tRNA-Moleküls wird von einer spezifischen Aminoacyl-tRNA-Synthase in einem zweistufigen Prozess mit der passenden AS beladen.