Alt-K. 19-20-21

Lysozym:

= Muramidase

• Lysozym kann die Zellwand von Bakterien auflösen.

• hydrolysiert glykosidische Bindungen (Lysozym wirkt auch als Glykosidase, da Glykosidase ein Enzym ist) und zerstört die bakterielle Zellwand -> die Mucopolysaccharide

  -> dabei werden die beta-1,4-glykosidischen Bindungen zwischen N-Acetylmuraminsäure (MurNAc) und N-Acetylglucosamin (GlcNAc) gespalten.

• gehört zu den Hydrolasen = beschleunigt die hydrolytische Spaltung

Praktikum:

• Reinheit:

  • man nimmt das abgetrennt Protein. Dieses wird mit SDS-Gelelektroporese (Na-Dodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) gereinigt. Erkennt man mehrere angefärbte Banden, so ist das Protein noch nicht gereinigt. Bei nur noch einer Bande, ist das Protein rein.

• Ausbeute und Konzentration/Gehalt:

  • Proteinkonz. der einzhelnen Konzentrationen durch die Bradford-Methode mit Coomassie Brilliant Blue G-250

  • durch die bestimmten Proteinkonz. kann der Anteil an Lysozym im Gesamteiweiß errechnet und die Ausbeute angegeben werden.

• Aktivitätstest:

  • wird photometrisch durchgeführt

Alternative?

-> ELISA (Versuch 3)

-> Aminosäureanalyse nach Totalhydrolyse (Versuch 4)

Quelle: V01 Protokoll

Glykogensynthese läuft über 4 enzymatische Stationen:

-> Synthese von Glykogen im Cytosol

• Ausgangspunkt: durch Hexokinase (Muskel und Leber) oder Glucokinase (nur Leber) aus freier Glucose Glucose-6-phosphat gebildet

  • ATP -> ADP

• Isomerisierung: durch Glucosephosphat-Mutase zum (isomeren) Glucose-1-phosphat

  • zunächst die Phosphatgruppe von einem phosphorylierten Serylrest im aktiven Zentrum des Enzyms auf das Substrat übertragen. Entstandenes Intermediat Glucose-1,6-bisphosphat gibt die C6-Phosphatgruppe wieder an den Serylrest ab.

• mit UDP-Glucose-Pyrophosphorylase zu UDP-Glucose

  • UTP -> PPi (= 2Pi)

  • es muss eine aktivierte Form der Glucose entstehen, dafür verknüpft das Enzym den Phosphatrest mit dem alpha-Phosphatrest von UTP. Die beta- und gamma- Phosphatgruppen werden als Pyrophosphat abgespalten.

  • Produkt: UDP-Glucose besitzt eine glykosidische Phosphoesterbindung mit hohem Gruppenübertragungspot. => aktive Bindung

-> bis hier reversibel

• durch Glykogen-Synthase wird Glykogen (n Glucose) mit UTP-Verbrauch zur verlängerten Glykogenkette (n+1 Glucose)

  • Irreversibel erst durch diese Hydrolyse von Pyrophosphat durch Pyrophosphatase

• Startprotein: Glykogenin, dass kann sich die ersten Glucosemoleküle selbst anhängen

  • angehängte Glucose muss aktivierte >sein = UDP-Glucose (entstammt aus der vorhergehenden Synthese von UDP-Glucose)

• wenn der Anfang gemacht ist, dann muss die Glykogensynthase (Enzym) die weitere Kettenverlängerung übernehmen.

————- bis hier, fertig.

-> gibt dann noch zur erweiterung die Verzweigung

Komplex 5:

• Zahl der Untereinheiten: 16

  • davon mitochondrial codiert: 2

• Funktion: Rückfluss von Protonen; ATP-Synthese

• d= 10 nm

• der kleinste und effizienteste Motor mit Wirkungsgrad von nahezu 100%

Nano-Rotationsmotor synthetisiert ATP:

• Komplex V = ATP-Synthase

  -> ist das Schlüsselenzym der mitochondrialen Energiegewinnung

  • ist ein großer Membranständiger Proteinkomplex (>500 kd)

• besteht aus 2 Segmenten: F1-Teil und FO-Teil

-> F1-Teil:

• an dem läuft die ATP-Synthese ab

• ragt kugelförmig in den Matrixraum hinein

• besteht aus 5 Untereinheiten

  • alpha-3, beta-3, gamma, delta und epsilon

-> FO-Teil:

• O = Hemmstoff Oligomycin (heißt daher so, weil er von Oligomycin gehemmt werden kann)

• ist in die innere Mitochondirenmembran integriert

• besteht aus 11 Untereinheiten

  • davon bilden alpha-1 und c-10 einen zentralen Protonenkanal

  • beta-2 OSCP1 (oligomycin sensitivity conferring protein) verbindet F1 mit F0

-> Ablauf:

• Fließen H+ an einem kritischen Aspartatrest der c-UE vorbei, so lösen sie eine Drehbewegung des c10-Rings (F0) in der mitochondrialen Membran aus

  -> zusammen mit Matrixseitiger gamma-delta-epsilon-UE von F1 bildet dieser Ring den Rotor

  -> Stator = assymetrisch befestigten UE alpha, beta und OSCP

  • verhindern das Mitdrehen des alpha3-beta-3-Hexamers

• Energie zur ATP-Synthese kommt durch: Rotation der konisch zulaufenden gamma-UE im Zentrum des alpha3-beta-3-Hexamers, die periodisch Konformationsänderungen in den kat.-Zentren an den Grenzflächen der 3 alpha-beta-Dimere bewirken.

-> ATP-Synthese:

• ATP-Synthaseaktivität von F1 kat. die stark endergone Synthese von ATP aus Pi + ADP

  • wird angetrieben durch H+-motorische Kraft des H+-Gradienten über die innere mitochondriale Membran

-> chemische Reaktion zur mechanischen:

• durch die mit der Drehbewegung des gamma-Motors eingehende Konformationsänderungen der beta-UE werden fest gebundenes neu synthetisiertes ATP aus seiner Bindungstasche herausgedrückt

  ->O-Zustand (Open)

• zweite Konformation schließt H2O aus der Bindungstasche des aktiven Zentrums aus und begünstigt Bildung von Phosphorsäureanhydridbindung zwischen ADP + Pi

  -> L-Zustand (die zweite Konformation) (Loose)

• dritte Konformation hat viel höhere Affinität für ATP als für ADP + Pi, daher senkt die Gleichgewichtskonstante der Reaktion auf nahezu 1 -> Substrate + Produkte liegen unter Standardbedingungen nahezu äquimolar vor

  -> T-Zustand (dritte Konformation) (Tight)

=> Proteinumgebung des aktiven Zentrums zahlt energetischen Preis für die Synthese, der dann durch mechanisches Aufbrechen der WW zu Produkt der Reaktion “rückerstattet” wird

=> durch strikte Kooperativität zwischen aktiven Zentren von F1 verhindert einen Leerlauf des Systems bei niedriger ADP-Konzentration

Klonierung von DNA mit PCR:

• PCR = Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

  • ist die einfachste Art, spezifische DNA- Segmente zu vervielfältigen

• Voraussetzung:

  • Teile der interessierten DNA-Sequenz muss bekannt sein

-> Verlauf:

• durch Sequenzinformationen werden 2 DNA-Oligonucleotide von je 15-20 Resten synthetisiert, die jeweils an einen der beiden komplementären Stränge hybridisiert und dabei exakt die DNA-Region begrenzen, die amplifiziert werden soll.

• 1. Denaturierung:

  • Reaktionsgemisch auf 95°C erhitzt

• 2. Annealing:

  • Abkühlen auf 55°C

  • Primer binden an die komplementären Einzelstränge und dienen als Starter für die DNA-Polymerasereaktion

• 3. Polymerasekettenreaktion

  • Synthese in 5`->3`Richtung, entlang der einzelnen Matrizenstränge

Also:

• durch kurzzeitiges Erhitzen (95°C) wird Initialreaktion unterbrochen, die neu gebildetetn Doppelstränge denaturieren

• bei T-reduktion (55°C) können große molare überschüssige Primer mit jeweils 2 Strängen (Eltern- und Tochterstrang) hybridisieren

• in der zweiten Runde synthetisiert DNA- Polymerase 4 Einzelstränge

-> Denaturierung, Annealing und Polymerase wiederholen sich so lange, bis 20-30 Reaktionszyklen zuende sind => DNA-Segment, das durch Lage der 2 Primer definiert wird, millionen- milliardenfach ampliziert wurde

Problem:

• PCR sehr anfällig für kontaminierende DNA

es gibt keinen Folgestrang / Okazaki-Fragment weil:

• an beiden 3’-Enden des zu vervielfältigenden DNA- Stranges ein Primer bindet, der dann unterbrechungsfrei zum 5’-Ende synthetisiert werden kann.

• es muss also nicht Stückchenweiße neu angesetzt werden.

Antiviraler WS:

• z.B. durch komplementäre Hemmung, wenn der WS komplementär zur Originalstruktur ist.

• bei Translation oder Transkription, wird das Ablesen der DNA bzw. RNA blockiert.

• verhindert so die Bildung der Virusproteine.

Posttranslationale Modi. haben eigentlich gar nichts mit serinaktiven Proteasen zu tun!

Posttranslationale Modifikationen:

• Proteinmodifizierung

Proteasen:

• Unterteilt in: Endopeptidasen und Exopeptidasen

  • Endopeptidasen spalten innerhalb einer Polypeptidkette

  • Exopeptidasen an ihren Flanken

• 4 Hauptfamilien von Proteasen:

  -> Unterscheidung durch Katalysemechanismus

  • Serinproteasen (Trypsin)

  • Aspartatproteasen (HIV-Protease)

  • Cysteinprotease (Caspasen)

  • Metalloproteasen (ACE =Angiotensin- konvertierendes Enzym)

• Enzymklasse “Serinprotease”:

  -> kat- Reste: Ser, His, Asp

  -> typische Vertreter:

  • Verdauung:Trypsin, Chymotrypsin, Elastase

  • Blutgerinnung: Thrombin, Plasmin, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor VII

  • Enzyme der Komplementsysteme: C1r, C1s, C2b, Bb, D

• nicht alle Proteasen arbeiten nach dem molekularen Muster der Serinproteasen

Trypsin = Serinprotease/ Hydrolyase:

• proteolytische Aktivität von Trypsin (Serinendopeptidase) => Pankreasenzym

• katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen innerhalb eines Polypeptids

• dabei entstehen Oligopeptide unterschiedlicher Länge

Spezifitätstaschen von Serinprotease:

• basischer Rest von Trypsin (Seitenkette) bestimmt die spezifität des Enzyms

• Trypsin spaltet hinter basischen AS-Resten

Katalysemechanismus von Trypsin:

• aktives Zentrum von Trypsin ist Ser195

• Ser195 startet nucleophilen Angriff auf Peptidbindung und transferiert sein Proton auf das benachbarte His57. Positiver Überschuss im Imidazolring von His57 wird dadurch mit negativ geladener Seitenkette von Asp102 kompensiert.

• tetraedrischer Übergangszustand:

  -> das C-Atom der Peptidbindung nimmt eine tetraedrische Geometrie ein. Im Übergangszustand besitzt der negativ geladene Carbonylsauerstoff das Oxyanion-Loch und bildet 2 H-Brücken mit dem Peptidrückgrad des Enzyms

• Acylierungsphase der Proteolyse:

  -> der aminoterminale Teil ist kovalent als Ester mit dem Enzym verbunden. Freigesetztes Fragment = dem carboxyterminalen Teil des Substrats, der über einen neu entstandenen freien Aminoterminus verfügt => Aminokomponente

• Decylierungsphase der Proteolyse:

  -> nucleophile Angriff von Wasser aus das Acyl-Enzym-Intermediat erzeugt einen weiteren tetraedrischen Übergangszustand. His57 unterstützt erst basenkat. diesen Angriff, dann säurekat. die Freisetzung der Acylkomponente. Freigesetztes Fragment = aminoterminalen ABschnitt des Substrats mit neu entstandenen Carboxyterminus => Acylkomponente

  -> bei der Trypsinkat. ist die terminale AS typischerweise ein Arginyl- oder Lysylrest

-> Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt eine einfache Enzymkinetik

• praktisch kann ein Enzym kinetisch bestimmt werden, durch messungen verschiedener Substratkonz. mit resultierender Reaktionsgeschwindigkeit => Substratverbrauch/ Produktzunahme pro Zeiteinheit

• dabei wird die Anfangsgeschwindigkeit V0 bestimmt

• dazu misst man die Reaktionsgeschwindigkeit in der Anfangsphase der Enzymreaktion

  • mit Annahme: in dieser kurzen Zeit ändert sich die Substratkonz. nur geringfügig, daher konstant bleibt.

=> die bei verschiedenen Substratkonz. gemessenen Anfangsgeschwindigkeiten werden graphisch zur Sättigungskurve ausgewertet.

• Graph = hyperbolishcer Kurvenverlauf. (bsp. O2- Bindungskurve des Myoglobins

• Anfangs:

  • geringe Substratkonz., es findet sich stets ein “freies” Enzym, dabei wird also jedes im aktiven Zentrum eintreffende Substratmolekül umgesetzt

  • Umsatzgeschwindigkeit steigt fast linear mit Substratkonz.

• dann Substratsättigung

  • Substratmoleküle treffen immer mehr auf Enzymmoleküle, die schon belegt sind.

  • Reaktionsgeschwindigkeit nähert sich Maximalgeschwindigkeit Vmax an => ist vom Enzym-Durchsatz vorgegeben

=> Michaelis-Menten-Komplex = Enzym mit Substrat bildet einen (allg.) reversiblen Komplex

• Aus Komplex entsteht das Produkt, wobei jeder Teilschritt durch Geschwindigkeitskonstante charakterisiert ist.

  • k1 = Bildung bzw. k-1 = Zerfall von E + S

  • k2 = Bildung von Produkt und freiem Enzym E

-> Michaelis-Konstante Km

• mit dieser Formel kann man hier nichts anfangen, da Geschwindigkeitskonstanten benötigt werden.

• Vmax ist das Maximum und Km ist bei der Hälfte von Vmax (diejenige Substratkonz., bei der die Halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wird weil die Hälfte der Enzyme ein Substrat gebunden hat).

Formel von der Enzymaktivität:

müsste trotzdem noch eine bessere Geben, die auf das Praktikum zugeschnitten ist.

• 10^6 kann ignoriert werden

• Harnstoff macht Proteine kaputt/ denaturiert Proteine (sofern er von außen zugesetzt wurde)

• Lactatdehydrogenase soll Lactat und Pyruvat ineinander umwandeln.

-> Probe normal: da wo sich aktivitäten nur langsam ändern. Normal = ohne erhöhte aktivität der Lactatdehydrogenase.

• beim Versuch 5 wird immer die NADH- Konz. gemessen. Daher wie schnell sich die extinktion ändert. Wenn sich die Extinktion von NADH zu schnell ändert, weiß man, dass ein Organschaden vorliegt.

Wie kommt es zustande?

• Allg.:

Ile: 113,2 g/mol

Leu: 113,2 g/mol

Trp: 186,2

• 412 g/mol (Wasser schon abgezogen) + 1 H2O = 430,6 g/mol

-> 431: kommen durch zusetzliche Protonierung am N-Ende zustande

->

• DNA- und Proteinsequenzen werden in internationalen Datenbanken (z.B. Genabank) gesammelt

• in der “Protein Data Bank” sind die Informationen zur 3D- STruktur von Proteinen abgelegt. In anderen datenbanken werden Proteine nach strukturellen Kriterien klassifiziert

tRNA: 214, 219, 316

= transfer-RNA

• etwa die Hälfte der Nucleotide einer tRNA bildet über intramolekulare Basenpaarung eine kleeblattförmige Struktur.

  • modifizierte Basen sind rot

• über weitere H-Brücken entsteht die hakenförmige Struktur der tRNA

-> transfer-Ribonucleinsäuren (tRNAs) besitzen kleeblattförmige Architektur und eine hakenförmige Raumstruktur.

• Die Anticodonschleife trägt ein Nucleotidtriplett, das komplementär zum Codon der mRNA ist.

• Die invariante, ungepaarte CCA-Sequenz am 3’-En

• de eines tRNA-Moleküls wird von einer spezifischen Aminoacyl-tRNA-Synthase in einem zweistufigen Prozess mit der passenden AS beladen.