Buffl

Alt-K. 19-20-21

Aw
von Anna-Elisabeth W.

SS19

  1. Komplex 5 aus der Atmungskette:

    • ATP-Synthase Lokalisation der Bestandteile nennen und Aufbau

    • Funktion des Komplexes erklären und die ATP-Synthese komplett beschreiben



Komplex 5:

  • Zahl der Untereinheiten: 16

    • davon mitochondrial codiert: 2

  • Funktion: Rückfluss von Protonen; ATP-Synthese

  • d= 10 nm

  • der kleinste und effizienteste Motor mit Wirkungsgrad von nahezu 100%

Nano-Rotationsmotor synthetisiert ATP:

  • Komplex V = ATP-Synthase

    -> ist das Schlüsselenzym der mitochondrialen Energiegewinnung

    • ist ein großer Membranständiger Proteinkomplex (>500 kd)

  • besteht aus 2 Segmenten: F1-Teil und F0-Teil

-> F1-Teil:

  • an dem läuft die ATP-Synthese ab

  • ragt kugelförmig in den Matrixraum hinein

  • besteht aus 5 Untereinheiten

    • alpha-3, beta-3, gamma, delta und epsilon

-> F0-Teil:

  • O = Hemmstoff Oligomycin

  • ist in die innere Mitochondirenmembran integriert

  • besteht aus 11 Untereinheiten

    • davon bilden alpha-1 und c-10 einen zentralen Protonenkanal

    • beta-2 OSCP1 (oligomycin sensitivity conferring protein) verbindet F1 mit F0

-> Ablauf:

  • Fließen H+ an einem kritischen Aspartatrest der c-UE vorbei, so lösen sie eine Drehbewegung des c10-Rings (F0) in der mitochondrialen Membran aus

    -> zusammen mit Matrixseitiger gamma-delta-epsilon-UE von F1 bildet dieser Ring den Rotor

    -> Stator = assymetrisch befestigten UE alpha, beta und OSCP

    • verhindern das Mitdrehen des alpha3-beta-3-Hexamers

  • Energie zur ATP-Synthese kommt durch: Rotation der konisch zulaufenden gamma-UE im Zentrum des alpha3-beta-3-Hexamers, die periodisch Konformationsänderungen in den kat.-Zentren an den Grenzflächen der 3 alpha-beta-Dimere bewirken.

-> ATP-Synthese:

  • ATP-Synthaseaktivität von F1 kat. die stark endergone Synthese von ATP aus Pi + ADP

    • wird angetrieben durch H+-motorische Kraft des H+-Gradienten über die innere mitochondriale Membran

-> chemische Reaktion zur mechanischen:

  • durch die mit der Drehbewegung des gamma-Motors eingehende Konformationsänderungen der beta-UE werden fest gebundenes neu synthetisiertes ATP aus seiner Bindungstasche herausgedrückt

    ->0-Zustand

  • zweite Konformation schließt H2O aus der Bindungstasche des aktiven Zentrums aus und begünstigt Bildung von Phosphorsäureanhydridbindung zwischen ADP + Pi

    -> L-Zustand (die zweite Konformation)

  • dritte Konformation hat viel höhere Affinität für ATP als für ADP + Pi, daher senkt die Gleichgewichtskonstante der Reaktion auf nahezu 1 -> Substrate + Produkte liegen unter Standardbedingungen nahezu äquimolar vor

    -> T-Zustand (dritte Konformation)

=> Proteinumgebung des aktiven Zentrums zahlt energetischen Preis für die Synthese, der dann durch mechanisches Aufbrechen der WW zu Produkt der Reaktion “rückerstattet” wird

=> durch strikte Kooperativität zwischen aktiven Zentren von F1 verhindert einen Leerlauf des Systems bei niedriger ADP-Konzentration

SS19

  1. Replikationsgabel zeichnen und mit Enzymen beschriften

    • Warum gibt es bei der PCR keinen Folgestrang/ Okazaki-Fragmente?

    • Es waren zwei Sequenzen gegeben, wobei die zweite was mit antiviralen WS zu tun hatte. man sollte erklären wie dieser genau anhand der Oligonukleotidsequenz wirkt.



Klonierung von DNA mit PCR:

  • PCR = Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)

    • ist die einfachste Art, spezifische DNA- Segmente zu vervielfältigen

  • Voraussetzung:

    • Teile der interessierten DNA-Sequenz muss bekannt sein

-> Verlauf:

  • durch Sequenzinformationen werden 2 DNA-Oligonucleotide von je 15-20 Resten synthetisiert, die jeweils an einen der beiden komplementären Stränge hybridisiert und dabei exakt die DNA-Region begrenzen, die amplifiziert werden soll.

  • 1. Denaturierung:

    • Reaktionsgemisch auf 95°C erhitzt

  • 2. Annealing:

    • Abkühlen auf 55°C

    • Primer binden an die komplementären Einzelstränge und dienen als Starter für die DNA-Polymerasereaktion

  • 3. Polymerasekettenreaktion

    • Synthese in 5`->3`Richtung, entlang der einzelnen Matrizenstränge

Also:

  • durch kurzzeitiges Erhitzen (95°C) wird Initialreaktion unterbrochen, die neu gebildetetn Doppelstränge denaturieren

  • bei T-reduktion (55°C) können große molare überschüssige Primer mit jeweils 2 Strängen (Eltern- und Tochterstrang) hybridisieren

  • in der zweiten Runde synthetisiert DNA- Polymerase 4 Einzelstränge

-> Denaturierung, Annealing und Polymerase wiederholen sich so lange, bis 20-30 Reaktionszyklen zuende sind => DNA-Segment, das durch Lage der 2 Primer definiert wird, millionen- milliardenfach ampliziert wurde


Problem:

  • PCR sehr anfällig für kontaminierende DNA


SS19

  1. Posttranslationale Modifikationen:

    • richtig oder falsch zu serinaktiven Proteasen und die Wirkungsweise bzw. welche Enzyme dazu gehören

    • es war eine Aminosequenz gegeben und anhand dessen sollte man sich AS raussuchen und mögliche Modifikationen erklären




Proteasen:

  • Unterteilt in: Endopeptidasen und Exopeptidasen

    • Endopeptidasen spalten innerhalb einer Polypeptidkette

    • Exopeptidasen an ihren Flanken

  • 4 Hauptfamilien von Proteasen:

    -> Unterscheidung durch Katalysemechanismus

    • Serinproteasen (Trypsin)

    • Aspartatproteasen (HIV-Protease)

    • Cysteinprotease (Caspasen)

    • Metalloproteasen (ACE =Angiotensin- konvertierendes Enzym)

  • Enzymklasse “Serinprotease”:

    -> kat- Reste: Ser, His, Asp

    -> typische Vertreter:

    • Verdauung:Trypsin, Chymotrypsin, Elastase

    • Blutgerinnung: Thrombin, Plasmin, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor VII

    • Enzyme der Komplementsysteme: C1r, C1s, C2b, Bb, D

  • nicht alle Proteasen arbeiten nach dem molekularen Muster der Serinproteasen

Trypsin = Serinprotease/ Hydrolyase:

  • proteolytische Aktivität von Trypsin (Serinendopeptidase) => Pankreasenzym

  • katalysiert die Hydrolyse von Peptidbindungen innerhalb eines Polypeptids

  • dabei entstehen Oligopeptide unterschiedlicher Länge


Spezifitätstaschen von Serinprotease:

  • basischer Rest von Trypsin (Seitenkette) bestimmt die spezifität des Enzyms

  • Trypsin spaltet hinter basischen AS-Resten

Katalysemechanismus von Trypsin:

  • aktives Zentrum von Trypsin ist Ser195

  • Ser195 startet nucleophilen Angriff auf Peptidbindung und transferiert sein Proton auf das benachbarte His57. Positiver Überschuss im Imidazolring von His57 wird dadurch mit negativ geladener Seitenkette von Asp102 kompensiert.

  • tetraedrischer Übergangszustand:

    -> das C-Atom der Peptidbindung nimmt eine tetraedrische Geometrie ein. Im Übergangszustand besitzt der negativ geladene Carbonylsauerstoff das Oxyanion-Loch und bildet 2 H-Brücken mit dem Peptidrückgrad des Enzyms

  • Acylierungsphase der Proteolyse:

    -> der aminoterminale Teil ist kovalent als Ester mit dem Enzym verbunden. Freigesetztes Fragment = dem carboxyterminalen Teil des Substrats, der über einen neu entstandenen freien Aminoterminus verfügt => Aminokomponente

  • Decylierungsphase der Proteolyse:

    -> nucleophile Angriff von Wasser aus das Acyl-Enzym-Intermediat erzeugt einen weiteren tetraedrischen Übergangszustand. His57 unterstützt erst basenkat. diesen Angriff, dann säurekat. die Freisetzung der Acylkomponente. Freigesetztes Fragment = aminoterminalen ABschnitt des Substrats mit neu entstandenen Carboxyterminus => Acylkomponente

    -> bei der Trypsinkat. ist die terminale AS typischerweise ein Arginyl- oder Lysylrest


SS19

  1. Enzymkinetik:

    • ein Graph war mit 2 Punkten gegeben, die man so verbinden sollte, damit ein Michaelis-Menthen-Graph entsteht. Vmax und Km ablesen.

    • Enzymkonzentration bei 0, Schichtdicke der Küvette, Absorptionskoeffizient und Volumen in der Küvette waren gegeben und man sollte Kcat und die Enzymaktivität [U/mg] bestimmen.


-> Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt eine einfache Enzymkinetik

  • praktisch kann ein Enzym kinetisch bestimmt werden, durch messungen verschiedener Substratkonz. mit resultierender Reaktionsgeschwindigkeit => Substratverbrauch/ Produktzunahme pro Zeiteinheit

  • dabei wird die Anfangsgeschwindigkeit V0 bestimmt

  • dazu misst man die Reaktionsgeschwindigkeit in der Anfangsphase der Enzymreaktion

    • mit Annahme: in dieser kurzen Zeit ändert sich die Substratkonz. nur geringfügig, daher konstant bleibt.

=> die bei verschiedenen Substratkonz. gemessenen Anfangsgeschwindigkeiten werden graphisch zur Sättigungskurve ausgewertet.

  • Graph = hyperbolishcer Kurvenverlauf. (bsp. O2- Bindungskurve des Myoglobins

  • Anfangs:

    • geringe Substratkonz., es findet sich stets ein “freies” Enzym, dabei wird also jedes im aktiven Zentrum eintreffende Substratmolekül umgesetzt

    • Umsatzgeschwindigkeit steigt fast linear mit Substratkonz.

  • dann Substratsättigung

    • Substratmoleküle treffen immer mehr auf Enzymmoleküle, die schon belegt sind.

    • Reaktionsgeschwindigkeit nähert sich Maximalgeschwindigkeit Vmax an => ist vom Enzym-Durchsatz vorgegeben

=> Michaelis-Menten-Komplex = Enzym mit Substrat bildet einen (allg.) reversiblen Komplex

  • Aus KOmplex entsteht das Produkt, wobei jeder Teilschritt durch Geschwindigkeitskonstante charakterisiert ist.

    • k1 = Bildung bzw. k-1 = Zerfall von E + S

    • k2 = Bildung von Produkt und freiem Enzym E

-> Michaelis-Konstante Km


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Anna-Elisabeth W.

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