NMDA in CHO Zellen

 glutamatinduzierten Transkriptionsaktivierung von Immediate-Early-Genes (IEGs) in CHO-K1-Zellen

• ERG expression zu untersuchen - nachdem NDMA Rezeptor mit Glutamat & Glycin aktiviert wurde

• Unterschiede zwischen den verschiedenen NDMA Untereinheiten

• CHO-K1-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, die für spezifische NMDAR-Untereinheiten codieren.

• Die Expression der IEGs wurde anschließend mittels quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR) gemessen

=eine Methode, um fremde Nukleinsäuren (DNA oder RNA) in eukaryotische Zellen einzubringen.

• Chemische Methoden:

  Lipid-basierte Transfektion (Lipofektion), Calciumphosphat-Fällung, DEAE-Dextran

• Virale Transduktion:

  Nutzung von Lentiviren, Retroviren, Adenoviren, um Gene effizient einzuschleusen

• Physikalische Methoden:

  Elektroporation, Mikroinjektion, Gene Gun

physikalische Methode zur Transfektion, bei der durch elektrische Pulse temporäre Poren in der Zellmembran erzeugt werden, um Nukleinsäuren oder andere Moleküle in die Zelle einzuschleusen.

Funktionsweise:

1. Zellen + DNA/RNA werden in eine leitfähige Lösung gegeben.

2. Kurzer elektrischer Puls erzeugt eine hohe transmembrane Spannung.

3. Lipid-Doppelschicht destabilisiert, Poren öffnen sich.

4. Nukleinsäuren treten ein (passive Diffusion oder Elektrophorese).

5. Membran regeneriert sich, Zellüberleben abhängig von Impulsparametern.

🔹 Parameter für eine erfolgreiche Elektroporation:

• Pulsstärke & -dauer: Hoch genug für Porenbildung, aber nicht zu schädlich.

• Zelltyp: Verschiedene Zelllinien erfordern angepasste Bedingungen.

• DNA-Konzentration: Zu hohe Mengen können Zellen schädigen.

• Medium: Ionenreiche Pufferlösungen verbessern Leitfähigkeit.

🔹 Vorteile:

✅Hohe Effizienz,

✅ breite Anwendbarkeit,

✅ geringe Toxizität,

✅ schneller Prozess, kontrollierbare Bedingungen

✅ Keine Verwendung von Chemikalien oder Viren nötig.

✅ Große Moleküle (z. B. Plasmide, Proteine) können eingebracht werden.

🔹 Nachteile:

❌ Hohe Zellmortalität, wenn Parameter nicht optimal sind.

❌ Spezielle Geräte erforderlich (teuer).

❌ Nicht für alle Zelltypen geeignet (empfindliche Zellen sterben schneller)

1. Transfektion der Zellen:

   • CHO-K1-Zellen wurden mit Plasmiden transfiziert, -> die für verschiedene NMDA-Rezeptor-Untereinheiten codieren (NR1, NR2A/NR2B).

   • Dies geschah mittels Elektroporation

2. Behandlung mit Glutamat und Glycin LSG:

   -> aktivierung NMDA-R & auslösen Signaltransduktion

   • Glutamat (100 µM) und Glycin (10 µM) in magnesiumfreier Lösung

   • mit unterschiedl Inkubationszeiten (0, 5, 10, 15, 30 & 60 Min)

3. RNA-Extraktion und cDNA-Synthese:

   • RNA isoliert

     -> Working Solution D enthält Guanidiniumthiocyanat (zerstört Wasserstoffbrückenbindungen) und Mercaptoethanol (spaltet Disulfidbrücken der RNAsen)

   • & in cDNA umgeschrieben.

     -> ermöglichte, die Expression spezifischer Gene quantitativ zu messen.

4. Quantitative Real-Time-PCR (qRT-PCR):

   • analyse der Expression der Immediate-Early-Genes

   • auswertung mithilfe der Delta-Delta-Ct-Methode

• IEGs = Gene, die schnell und ohne vorherige Proteinbiosynthese auf neuronale Stimuli reagieren.

• Sie regulieren als Transkriptionsfaktoren die Expression weiterer Gene und sind somit essentiell für neuronale Plastizität.

• Im Versuch wurden c-FOS,cJun und EGR1 zur Analyse der NMDAR-Aktivierung untersucht.

  • EGR1: o   Modulation der synaptischen Plastizität = Umgestaltung von Dendriten und Synapsen & Bildung neuer synaptischer Verbindungen

  • cFos & cJun bilden den AP1 Komplex

  • cJun: Gene für vesikulären Transport & Freisetzung von Neurotransmittern

    - c-Fos: aktiviert Gene, die für Exozytose von Neurotransmittern wichtig sind

Synaptische Plastizität ist die Fähigkeit von Synapsen, ihre Stärke zu verändern. Der NMDAR ist wichtig für LTP, da er als Koinzidenzdetektor fungiert und nur bei gleichzeitiger Glutamatfreisetzung und Depolarisation aktiviert wird. Der Calcium-Einstrom verstärkt die synaptische Verbindung.

• Ionotrope Rezeptoren:

  Ligandengesteuerte Ionenkanäle (schnelle Signalübertragung, z. B. NMDAR).

• Metabotrope Rezeptoren:

  G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (langsame Signaltransduktion über Second Messenger).

CHO-K1-Zellen sind leicht kultivier- und transfizierbar. Sie besitzen keine endogenen NMDARs, was eine gezielte Untersuchung spezifischer Untereinheiten nach Transfektion ermöglicht.

qRT-PCR misst die Menge an cDNA eines Zielgens in Echtzeit durch fluoreszierende Marker. - Die Delta-Delta-Ct-Methode wird zur Auswertung verwendet: Ct-Werte des Zielgens werden relativ zu einem Referenzgen (z. B. 18s rRNA) normalisiert, um Veränderungen in der Genexpression zu berechnen.

Magnesium blockiert den Ionenkanal des NMDAR bei Ruhepotentialen. Eine magnesiumfreie Lösung ermöglicht die Öffnung des Kanals bei Depolarisation durch Glutamat und Glycin.

Die unterschiedlichen NR2-Untereinheiten (z. B. NR2A vs. NR2B) beeinflussen die Kinetik und Calciumleitfähigkeit des Rezeptors sowie dessen Signalwege. Dies kann zu variierenden Expressionslevels von IEGs führen.

Calcium dient als Second Messenger und aktiviert Signalwege (z. B. CaMKII, MAPK), die zur Transkription von IEGs führen und langfristige Veränderungen in der Synapse bewirken.

Überaktivierung: Führt zu Exzitotoxizität (z. B. Schlaganfall, Alzheimer). - Unterfunktion: Kann mit Schizophrenie oder kognitiven Defiziten assoziiert sein.

• RNA-Sequenzierung: Liefert ein umfassendes Transkriptomprofil.

• Northern Blot: Analysiert spezifische RNA-Moleküle. -

• Western Blot: Misst Proteinexpression als indirektes Maß für Genexpression.

NMDA-Antagonisten wie Memantin zur Behandlung von Alzheimer. - Modulatoren zur Regulierung von Über- oder Unterfunktionen bei neurologischen Erkrankungen wie Epilepsie oder Schizophrenie.