Herzog/Ober

ZUSAMMENFASSUNG GRUNDLAGEN

KLAUSURRELEVANT

Die höchst unsympathische Herzog began mit einigen Grundlagen, die ich auf dieser Karte neu zusammenfasse:

Durch die Befruchtung entsteht eine diploide Zygote. Dipolid bdeutet einen Chromosomensatz von 2n = 46 Chromosome in 23 Paaren. Jetzt lässt sich die Entwicklung von fast jedem vielzelligen Tier in charakteristische Abschnitte teilen.

1. Nenne die charakteristischen Abschnitte der Entwicklung ab dem Zeitpunkt der Befruchtung.

   
   

Wichtig ist dabei besonders die Gastrulation:

1. Welche Zellltypen und Organe bilden Ektoderm, Endoderm und Mesoderm?

Im Laufe ihrer Entwicklung durchlaufen Zellen allerhand Prozesse. Die vier wichtigsten:

• sie teilen sich

• sie spezialisieren sich

• sie interagieren miteinander

• und sie wandern

Schauen wir uns die Zellproliferation nocheinmal genau an. Es bilden sich viele Zellen aus einer Vorläuferzelle. Sowie bei der Furchungsteilung. Die daraus entstehende Blastula hat Zellen die totipotent und pluripotent sind.

1. Was bedeutet totipotent und pluripotent?

Zellwanderung ist ebenfalls ein wichtiger Prozess.

Auf diesen Bildern sehen wir wie grün angefärbte Zellen in A später ins Gehirn wandern. Darauf basierend können wir einen Anlageplan erstellen.

Hierbei ist zu beachten, dass die Achsen bei einem frühen Embryo noch animal und vegetal genannt werden weil sich anterior und posterior erst noch ausbilden.

Wir haben gelernt , dass sich aus Endoderm beispielsweise Magen und Pankreas bilden, aus Ektderm Haut und Hirnzellen und Mesoderm bildet Herz und Niere. Die 100 Pence Frage lautet:

1. Wenn nicht aus Ekto-, Endo- oder Mesoderm, aus was werden später Eizellen und Spermien, also Gameten, gebildet?

Und das ist schon magisch in der Entwicklungsbiologie - du hast es schon mal gehört: Körperzellen - genannt Soma - entwickeln sich zu Organen und was wir sonst so brauchen. Aber sie sterben irgendwann. Wie wir auch. Aber Gameten, die Zellen, die aus der Keimbahn kommen, sind potenziell unsterblich.

Hier können wir sehen welche Auswirkungen eine Mutation im Soma auf nachfolgende Generationen hat - richtig. Keine. Erst ene Mutation in den Keimzellen sorgt dafür dass beispielsweise auch alle Fische die später kommen grün leuchten. :)

Zurück zur Zellspezialisierung: Du hast auch schon mal von Spezifizierng und Determinierung gehört. Die blöde Frau Herzog hatte hier ein schönes Beispiel:

In diesem Schaubild nehmen wir eine grüne Zelle und packen sie in gelbes Gewebe. Im Fall der Spezifizierung: sie sind versehentlich im Mathekurs gelandet und müssen jetzt Mathe lernen. Im Fall der Determinierung: sie sind versehentlich im Mathekurs gelandet, haben aber ihr Biobuch mitgebracht. Ha. So oder so: Ob spezifiziert oder determiniert ist ein Zeitfaktor.

Zuletzt: Determinanten und Morphogene. Du kennst sie schon.

1. Klausurfrage: Definiere maternale Gene, Morphogene, zygotische Gene

2. Definiere das French Flag Modell

3. Definiere Determinanten

VORLESUNG 1: Gefäßentwicklung - Herzog

Das ist ein kleines Zebrafischchen. In Grün sehen wir Blutgefäße und in rot sehen wir die Blutkörperchen. Es ist ein transgener lebender Fisch.

1. Was bedeuten Tg(krdl:GFP) und Tg(gata1:dsRed)?

Diese drei Hübschen haben den Nobelpreis bekommen. Besonders stolz sind wir natürlich auf Christiane Nüsslein-Vollhard. Sie bekamen den Nobelpreis für die Entdeckung der genetischen Kontrolle der frühen Embryonalentwicklung. Wir wollen wissen welche Gene die Embryonalentwicklung regulieren.

Der Ansatz lautete so: Wir nehmen das Genom einer Fruchtfliege und fügen Mutationen ein, ganz willkürlich. Die sich daraus entwickelten Embryonen wurden unter dem Mikroskop untersucht, und ihnen wurden Namen gegeben. Je nach Aussehen (z.B. odd). Nach und nach wurde das entsprechende Gen idenifiziert und eine Hierachie entdeckt.

Aber wie funktioniert so ein Screen genau? (Eigenrecherche)

Angewandt konnte man auf diese Art in Erfahrung bringen, was für ein Gen bzw Protein für das Hennekamm-Syndrom verantwortlich war - Das Hennekamm-Syndrom ist eine genetische Erkrankung die vorallem das lymphatische Gewebe betrifft. Durch die erweiterten Lymphgefäße bilden sich Lymphödeme.

1. Welches Protein ist verantwortlich für das Hennekam-Syndrom?

2. Nenne ein paar Punkte, die für den Zebrafisch als Modellorganismus sprechen.

VORLESUNG 2: Gefässe: Herzog - Erzeugen transgener Fische

FOKUSFRAGEN

KLAUSURRELEVANT

Wie manipuliere ich einen Fischembryo?

Da habe ich verschiedene Möglichkeiten.

1. FOKUSFRAGE: Erläutere 5 Möglichkeiten, wie ein Fischembryo manipuliert werden kann.

2. FOKUSFRAGE: Was ist genregulatorisches Element und was möchte ich damit bewirken?

3. FOKUSFRAGE: Ich möchte eine transgene Fisch-linie erzeugen. Wie mache ich das?

4. FOKUSFRAGE: Welche Probleme können beim Erzeugen von transgenen Fischen auftauchen?

5. FOKUSFRAGE: Wie kann ich die Spezifität nachweisen?

6. FOKUSFRAGE: Wie generiere ich ein knockdown mit Morpholinos?

7. FOKUSFRAGE: Wie kann durch Morpholino ein knockdown erzeugt werden?

Aus dem Gedächtnisprotkoll:

aplnr Morpholino vs. Genschaltung mittels Cre Rekombinase (ein bisschen dazugeschrieben, wo die Experimente erklärt wurden) Welche Aussagen kann man aus den folgenden Experimenten treffen? Welche wäre aussagekräftiger?

VORLESUNG 2: Gefässe - Herzog: Elabela-Apelin-Signalweg - ZUSAMMENFASSUNG

KLAUSURRELEVANT

doi: 10.7554/eLife.06726

transgen.de/forschung/1545.neue-zuechtungsverfahren-uebersicht.html

Wir beschäftigen uns jetzt mit einem Paper auf das Frau Wiebke Herzog offenbar besonders stolz ist: der Elabela -Apelin-Rezeptor Signalweg zur Regulierung von Endothelzellen-Wanderung.

Kurz, was sind Endothelzellen?

Spezialisierte Zellen (was das bedeutet wissen wir ja inzwischen) welche die innere Oberfläche der Blutgefäße auskleiden.

Also was wir hier in grün sehen, das sind Angioblasten, also eine Angioblastenmigration. Der erste Kreislauf wird gebildet durch die Bildung der Aorta und der Kardinalvene und zwar indem Angioblasten im Mesoderm der lateralen Platte spezifiziert werden (zu Endothelzellen)…

und dann zwischen den Somiten (Segmente in der Embryonalentwicklung) in Richtung Mittellinie wandern wo sie miteinander verschmelzen.

Ursprünglich dachte mann der Wachstumsfaktor A (VEGF-A) - lol random name, wäre dafür verantwortlich aber Frau Herzog fand raus - dem ist nicht so! Stattdessen wurde ein kleines Peptid entdeckt, es heißt Apelin. Seine Rezeptoren heißen aplnra und aplnrb (achte auf das r darin für Rezeptor) und sind während der Angioblastenwanderung exprimiert:

aplna und aplnb sind Paraloge. Jetzt kommen Morpholinos ins Spiel - also ein gezielter Knock-out.

Wenn ich die Gene für die Rezeptoren lahm lege, ist das wichtig für die Angioblastenwanderung?

Turns Out - Ja. Sehr wichtig. Das Ausschalten von aplnra oder aplnrb verringerte die Effizienz der Angioblastenwanderung, die Angioblasten verbleiben teilweise auf Wanderungsstrecke (Bild 2 und 3). Wenn man beide ausschaltet bleibt die Angioblastenwanderung gänzlich aus (letztes Bild).

Wie sieht so ein Apelin-Rezeptor eigentlich aus?

Es ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor. Den kennen wir bereits aus Grundlagen I Nitschke:

(kleine Erinnerung: CREB/CRE Signalweg)

Okay. Was ist dann der nächste Schritt? Wir möchten nicht nur einen transienten Knock-Out, wir wollen richtig das Genom editieren.

Wie machen wir das? CRISPR/Cas9 oder TALEN. Wie funktioniert das on detail nochmal?

CRISPR/Cas:

Ein DNA Strang soll an einer vorgegebenen Stelle durchgeschnitten und gezielt verändert werden. Es ist in allen Organismen anwendbar, auch in Pflanzen. Der Mechanismus stammt von Bakterien: Bei einer Infektion in einem Bakterium spaltet Cas, ein Schneideprotein die DNA eines Viruspartikels auf. Die Bruchstücke werden in kurzen sich wiederholenden Fragmenten in einen peziellen Abscnitt (CRISPR - clustered regularly interspaced short palindromic repeats) ins Erbgut eingefügt.Kommt es zu einer erneuten Infektion mit Viren wird deren DNa verglichen mit den Repeats, stimmt es überein, kommt Cas und macht zerhexelt das Virus erneut. Das daraus entwickelte verfahren CRISPR/Cas (Nobelpreis Doudna und Charpentier) läuft in drei Schritten ab:

Ziel finden: Das Schneideprotein Cas findet zusammen mit der Guide RNA die entsprechende Sequenz in der DNA.

Schneiden: Cas schneidet

Reparieren: Zelleigene Reperatursysteme fügen Basen ein, die dafür sorgen, dass das Gen z.B. untauglich wird oder fügen neue Sequenzen ein

Es gibt noch weitere Alternativen: Zink-Finger und Talen:

Bei TALEN (Transcription activator like effector nuclease) sind künstlich hergestellte Restriktionenzyme. Sie schneiden einen DNA Strang einer definierten Stelle. Dann werden zelleigene Reperaturmechanismen genutzt um die DNA zu editieren. Die Herstellung eines TALEN Systems ist sehr aufwendig, heute dominiert CRISPR/Cas.

So, long sory short - Mit CRISPR/cas9 wurden Mutationen in aplnra und aplnrb eingeführt. Die Gene funktionieren nicht mehr. Aufgrund der Erkentniss aus den Morpholino-Knockouts, wo wir sahen, dass das Ausschalten beider Rezeptoren zu einem gestaffelten Effekt führte, untersuchte man die Phänotypen der Nachkommen von aplnra+/- und aplnrb +/-. Man sah sich den Phänotyp also an und teilte in vier Kategorien: normal, mild, stark und stärker. Damit ist gemeint wie stark oder schwach die Angioblastenwanderung gestört war.

Wir sehen also: Bei einem kleinen Fisch der beide Allele für aaplnra und aplrb trägt ist alles guti. sobald aber ein Fischchen kein aplra Allel mehr hat kann man schon milde und stärkere Phänotypen erkennen und richtig doof wen beide Allele von aplnrb fehlen.

Jetzt lautet die Frage: sind die Gene die für Apelinrezeptor a und b (aplnra und aplnrb) kodieren, zellautonom?

Um zu beweisen, dass die Ela-Aplnr-Signalgebung in Angioblasten direkt erforderlich ist, führten wir Transplantationsexperimente durch. Wir haben Fische die durch Morpholino ein Knockout in denen Genen aplnra und aplnrb erhalten haben. Ein Kontroll-KO, ein aplnra/b- knockout und ein wildtyp. Denen entnehmen wir Zellen und transplantieren sie in Wt, aplnra/b+ Morpholino knockout.

Und wo ist hier der Witz: das letzte Bild E: Wenn ich gesunde Wildtyp-Zellen nehme und diese in eine aplnr-defiziente Umgebung setze können sie trotzdem zur Mittellinie wandern -es ist zellautonom.

Jetzt untersuchen wir den Liganden für Apelinrezeptoren: Apelin.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Myokardenentwicklung im Zebrafisch von Apeelinrezeptoren abhängt, aber der Phänotyp mit fehlenden Apelinrezeptoren kann nur durhc fehelndes Apelin nicht kopiert werden. Die vermutung liegt also nahe, dass es einen zweiten Liganden gibt. Und das stimmt, der zweite Ligand trägt den schönen Namen Elabela. Mittels in situ Hybridisierung konnte die Expression von Ela in der Chorda dorsalis nachgewiesen werden.

Was ist die Chorda dorsalis?

Ein langer dünner und biegsamer Stab im Rückenbereich der Chordatiere.

Eine Mutante die nun kein Ela mehr hat - die hat auch eine stark gestörte Angioblastenwanderung.

Und nun eine letzte Erkenntniss aus diesem Paper: Die Angioblastenwanderung ist von der Chorda dorsalis (Notochrod NC) abhängig ist. Dafür schauen wir uns zwei Mutanten an: noto - hat keine Chorda dorsalis und ta - hat eine defekte Vorläuferdifferenzierung. Angioblasten in noto wandern nicht zu Mittellinie, Angioblasten in ta tun das aber erreichen ihre Zielstruktur nicht. Die Ela Expression war in ta in der Mittellinie stark verringert. Also was tun?

Kann ich das durch Ela wieder reparieren? Und wenn ja, wie mache ich das?

Ich nehme mir ein Plasmid, ein Promotorfragment namens shh (sonic hedgehog), der ermöglicht die Expression von Ela, Tol2-Fragmenten und einer Tol2-Transposase mRNA, die eine mosaikartige Ela-Überxpression ermöglicht. Somit war der Effekt wieder reparierbar.

Warum ist Ela so wichtig? Wirkt es als Chemoattractant oder eher motogen - also für die Zellmobilität?

In der eröffentlichkung Pauli et al 2014 heißt es Ela wirkt motogen bei der Mesodermmigaration. In dem Paper überexprimieren wir Ela n ektopischen Stellen in noto und ta-Mutanten weil die ja kein Ela exprimieren. Wir nehmen einen heat-shock-promotor (hsp70) - weil man so die Expression regulieren kann. und so weiter mehr hab ich keine Lust mehr. Es wirkt jedenfalls als Chemoattraktant.

VORLESUNG 2: Gefässe - Herzog: Elabela-Apelin-Signalweg - FRAGEN

KLAUSURRELEVANT

Herzog will vorallem wissen was man tun muss bei welcher Fragestellung, nicht nur die Ergebnisse des Papers.

1. Was für eine Art Rezeptoren sind aplnra und aplrb?

2. Ich kreuze aplnra +/-; aplnrb +/- mit aplnra +/-; aplnrb +/-, wie viele Rezeptormutanten krieg ich?

3. Sind die Gene für Apleinrezeptor a und b (aplnra und aplnrb) zellautonom für Angioblasten im Zebrafisch? Wie kann ich das nachweisen?

   (Aus Gedächtnisprotokoll: Keine Angioblasten in der Mittellinie von aplnra/b MO Donorzellen; Alle Angioblasten in der Mittellinie von WT Donorzellen. Sind Apelin Rezeptoren in Endothelzellen (Angioblasten) wichtig für die Zellwanderung? Zell-Autonom?)

4. Wie heißen die beiden Liganden für aplnraund aplnrb?

5. Kann der Phänotyp fehelnder Apelinrezptoren durch fehlendes apelin ersetzt werden?

6. Was versteht man unter der Chorda dorsalis?

VORLESUNG 3: Organspezifizierung - Ober - ZUSAMMENFASSUNG

Ganz zu Beginn haben wir uns ins Gedächtnis gerufen was eigentlich Ekto- Endo undMesoderm sind.

1. Welche Zellltypen und Organe bilden Ektoderm, Endoderm und Mesoderm?

Ektoderm: Haut, Nerven, Gehirn, Sinnesorgane

Mesoderm: Herz, Nieren, Lymphknoten, rote Blutzellen, Knochen und Muskulatur

Endoderm: Lunge, Darm und Leber, Pankreas, Schilddrüße und Thymus

Beschäftigen wir uns jetzt mit der Leber - einem endodermen Gewebe. Hier in der Entwicklungsbiologie wird ja immer der Zebrafisch bevorzugt.

Hier können wir sehen, dass zum Beispiel unser Verdauungssystem gar nicht so unähnlich dem eines Zebrafisches ist. Die anteriore und posteriore Anordung der Organe stimmen weitgehend überein. Auch molekulare Mechanismen und Signalwege sind weitgehend konserviert.

Nach 5 Tagen haben sich aus den Vorläuferzellen Prox1 eine schicke Leber gebildet. Die Bauchspeicheldrüße, auch Pankreas genannt entwicklet sich parallell zur Leber. Hier kann man sehen, dass sie durch zwei fusionierende Knospen - dorsal und ventral bud - entsteht:

Organe wie Leber und Pankreas haben Vorläuferzellen, aus denen sie sich schließlich entwicklen. Die Frage ist, wie funktioniert das genau? Welche Signale induzieren das Zellschicksal Leber?

Die Leberentwicklung hat mit dem umgebenden Mesoderm zu tun. Leber ist immer von Mesoderm umgeben. Die Entwicklung der Leber kann in zwei Phasen eingeteilt werden:

1. Die Hepatogene Kompetenz: im Vorderdarm also eine intrinsische Kompetenz aus dem Endoderm-Gewebe

2. Die Leber Spezifikation: Signale vom Mesoderm wirken auf das Endoderm

Beschäftigen wir uns zuerst mit Phase 1: der heptogenen Kompetenz. Ein Transkriptionsfaktor ist hier essentiell: Er heißt FoxA und ist im Vorderdarm, Ohne FoxA kann es keine Leberanlage geben. Was macht FoxA genau? -FoxA ist angelegt, bevor es zu einem Zellschicksal kommt. Er wirkt als Pioneer-Transkriptionsfaktor aus das Chromatin.

Phase 2: Signale vom Mesoderm auf Endoderm - die Spezifikation der Leber. Hier sind ein paar andere Transkriptionsfaktoren relevant: Bmp4 und Fgf1/2.

Hier sehen wir dass es nur zu einem notwendigen Schritt der Leberentwicklung kommt, wenn entweder Endoderm mit MEsoderm in Kontakt tritt oder man die beiden Transkriptionsfaktoren Bmp und Fpf dazugibt. Dabei sei aber angemerkt dass es noch weiterer Signale bedarf, dass sich die Leber spezifizieren kann. Bmp4-Mutanten z.B. zeigen einen eher milden Phänotyp.

Welche Transkriptionsfaktoren können also noch eine Rolle spielen?

Ein Ansatz könnte genetic forwards sein. Dabei fügt man ungerichtete Mutationen durch ein Mutagen in ein

Organismus, untersucht den Phänotyp und bestimmt anschließend das mutierte Gen. Jedoch isnd Zebrafische zwar transparent aber ers ist trotzdem schwer zu erkennen mit bloßem Auge ob es zu einem sichtbaren Defekt bei der Leberentwicklung kam. Deswegen wärs gut es würde leuchten.

So. Und dann hat man tatsächlich einen Phänotyp entdeckt, er heißt Prometheus kurt prt.

Hier sehen wir drei prt Typen neben dem Wildtyp - Der Pankreas ist da aber keine Leber. Das Gen, dass hier mutiert wurde heißt wnt2bb. Es kodiert wahrscheinlich zusammen mit anderen Genen für Lebervorläuferzellen wie FoxA - kennen wir schon und einem zweiten namens hhex. Ist dieses Gen mutiert, dann kommt es jedenfalls nicht zu Lebervorläuferzellen.

Also wnt2bb. Der wnt-Signalweg, da klingelt noch irgendwo was. Der ist wichtig und scheinbar auch wichtig fir die Leberentwicklung. Schauen wir nochmal auf den wnt/betacatenin-Signalweg:

Aus der Skizze solltest du nur eins mitnehmen: normalerweise ist beta-catenin an einem Komplex gebunden und kann nicht als TF wirken. Bindet wnt an eine Struktur namens Frizzled an der Zelloberfläche löst sich der Komplex und beta-catenin kann im Zellkern als TF wirken.

ok. wnt ist wichtig. Wo ist wnt jetzt aktiv? Ist wnt zellautonom?

Was machen wir wenn wir das wissen wollen? Zelltransplanatation. Das haben wir schonmal gemacht als wir wissen wollten ob Apelin-Rezeptor-Gene Zellautonom sind. Wir nehmen wildtyp Zellen aus einem Embryo und transplantieren die in prt. Da können sie an unterschiedlichen Orten landen. Wir erinnern uns prt kann durch das mutierte wnt2bb keine Vorläufer bilden.

Landen sie im Endoderm - kann keine Lber mehr gebildet werden, keine rescue. Aber wenn die wildtypzellen mit einem funktionierenden wnt2bb-Gen im Mesoderm landen, entwicklet sich wieder eine Leber. Also ist das Gen relevant für Pahse 2: Die Wirkung von Mesoderm auf Endoderm. Damit ist wnt2bb nicht zellautonom, es ist abhängig von seiner Ungebung.

Ok und wo sitzt wnt2bb jetzt? Wo ist es exprimiert?

Wir sehen schon es sind immer ähnliche Fragestellungen. Wir schauen es uns mit in-situ-Hybridierung an.

-> es befindet sich im Mesoderm.

Wir schauen uns jetzt das wnt2 Gen an.

Wir fragen uns - kann das Protein wnt2 den Phänotyp prt retten?

Die Aufgabe lautet: wie testen sie ob wnt2 den VErlust von wnt2bb kompensieren kann? Welches Ergebniss erwarten sie?

Wir wollen außerdem wissen, ist wnt2 wichtig für die Leberentwicklung? Das ist einfach - da macht man einen knockout. Aber ersteres verstehe ich nicht - muss mal Annika fragen. Wenn ich wissen woll ob wnt2 den Phänotyp von wnt2bb kompensieren kann, wieso sollte ich dann wnt2 in der Mutante ausknocken? Dann hab ich doch weder wnt2 noch wnt2bb… Egal.

Wnt 2 und wnt2bb sind jedenfalls essentiell für die Leberspezifikation.

Hier sieht man auf jeden fall dass wenn man wnt2 vor einen hsp setzt sich mehr Lebergewebe bildet.

Diese Grafik fasse es am Ende wahrscheinlich ganz gut zusammen. Hier sehen wir die Leberwnticklung bei:

• wildtyp bei dem mit einem hsp wnt2bb hochreguliert wird: mega viel leber

• dann den wildtyp: normal viel Leber

• Der Morpholino ko von wnt2: wenig leber

• unsere prometheus mutante; kaum leber

• in der prometheus mutante wurde wnt2 durch morpholinos ausgeknockt: nix mehr leber.

VORLESUNG 3: Organspezifizierung - Ober - FRAGEN

1. Wie nennt man die Lebervorläuferzellen i Zebrafisch?

2. Wann habe ich im Zebrafisch eine funktionierende Leber?

3. Wie und wann entwickelt sich im Zebrafisch die Bauchspeicheldrüße?

4. In welche zwei Phasen lässt sich die Leberbildung einteilen?

5. Ordne diese Transkriptionsfaktoren der jeweiligen Phase zu: Bmp, FoxA und Fpf

6. Kann Phase 2, also die Spezifizierung der Leber, nur durch die Transkriptionsfaktoren ausgelöst werden?

7. Was zeichnet den Prometheus-Phänotyp aus?

8. Welches Gen ist in prt mutiert?

9. Was verursacht diese Mutation?

10. Ist das Gen Zellautonom? Wie kann es nachweisen?

VORLESUNG 4: Zell-Zell-Kommunikation und links/rechts Asymmetrie der Organe - Ober - ZUSAMMENFASSUNG

Wir beginnen mit diesem kryptischen Bild:

Die Fragen lautet:

Was wurde hier gemacht?

Hier wurde überprüft ob ftp zellautonom ist.

Wie heißt die Technik?

Zelltransplanatation

Was besagt das Ergebniss?

ftp wird zellautonom in den Kiemenbögen benötigt, nicht im umliegenden Gewebe. Woher weiß ich das? Links abgebildet ist der wildtyp, rechts der Mutant (hat keine Kiemebbögen). In der Mitte wurden dem Mutant Zellen eines Wildtyp injiziert. Dort wo sie an den Kimenbögen transplantiert wurden, konnten sich wieder Kiemenbögen bilden.

Wir sehen an dieser Folie hier, dass es eine Hierachie der PRoteine gibt bei der Leberentwicklung:

frizzled- dann wnt2bb (deren mutante prometheus heißt) dann wnt2 und wnt2bb und cann cdx1b.

Der wnt Signalweg ist eine parakrine Übertragungsart. Juxtakrin heißt Kontakt-abhängig. Das beschäftigt uns jetzt genauer:

1. Der Notch Singalweg:

Der Notch-Signalweg ist eine kontaktabhängige Zellkommunikation. Was ist der Notch Signalweg? Notch heißt soviel wie “Kerbe” und wurde bei Drosophila entdeckt mit gekerbten Flügeln:

Wir sehen in hellblau: den Liganden und in grün: den Rezeptor. Liganden und Rezeptor sind beide membrangebunden. Um den Notch-Signalweg zu aktivieren muss ein direkter Zell-Zellkontakt gewährleistet sein. Es muss ein mechanischer Zug auf den Notch-Rezeptoren liegen um den Prozess in Gang zu bringen.

Aus NICD kann sich ein aktivierender oder reprimierender Komplex zusammensetzen und so auf das Gen wirken. Du kannst dir noch merken, dass die Liganden Delta-like heißen, zum Beispiel. und die Rezeptoren “Notch-Rezeptoren.”.

Bei den Borstenvorläufer-Zellen in Drosophila (borstenvorläufer sind die Vorläuderzellen aus denen sich dann die feinen Häärchen entwicklen, die für die Wahrnehmung von Vibration ect. verantwortlich sind) sehen die Zellen hexagonal aus:

Aber wenn man genau hinsieht, erkennt man Filopodien, die über mehrere Zellen hinweg Notch-Signallübertragung machen.

Ein weiteres Beispiel für juxtakrine Signalübertragung: Der ephrin-Signalweg.

Wichtig zu wissen: Ephrin B bindet ein EphB-Rezeptoren, Ephrin A bindet an EphA Rezeptoren und der Komplex der entsteht kann bidirektional genutzt werden (forward und reverse signaling)

Der Ephrin-Signalweg spielt eine Rolle wie wir sehen und Reize weiter verarbeitet werden. Da gibt es eine Karte die kennst du schon:

Oben sind die Augen. Links ist die temporale Seite und rechts die nasale Seite und die leiten entweder in den anerioren Teil des Gehirns (temporal) oder in den posterioren Teil des Gehirns (nasal). Ach Schau an, der Friedrich Bonhoeffer, der Neffe von Dietrich Bonhoeffer. Der hat dazu was relevanes herausgefunden:

Er wollte wissen welche molekularen Signale dafür sorgen, dass Axone in die richtige Richtung wachsen. Dazu nahm er Tectum - Teil des Hühnergehirns und schnitt es in Streifen. Vorderes Tectum, Hinteres Tectum, Vorderes, Hinteres…. Dann nahm er Dorsale und ventrale REtina Neuronen aus dem Auge eines Embryos… was geht eigentlich bei den Entwicklungsbiologen…. und wurden auf die Streifen gesetzt. Dann beobachtete er in welche Richtung die Axone wuchsen. Bestimmte Regionen wurden von den Axonen gemieden, oder bevorzugt. Dort herrschten attractive oder repulsive Signale. Ephrin-A wurde später als einer von diesen identifiziert.

So sah das dann aus - du siehst die temporalen Axone wachsen auf anteriorem Gewebe. Das passt zu der Karte. Während die nasalen Axone einmal durch das ganze Tectum müssen bis in den posterioren Bereich.

Schauen wir uns EphrinA2 und ephA3 an. Achtung! EphA3 ist der Rezeptor und Ephrin A2 der Ligand.

So schaut die Expression von Rezeptor und Ligand aus:

Werfen wir einen Blick zurück auf die Leber, genauer auf die links-rechts Asymmetrie im Körper.

Das sogenannte Kupffers Vesikel bestimmt die Links Rechts Achse im Fisch. Die Mutnte has(heartandsoul)/apkc zum beispiel ist komplett symmetrisch…das ist nciht normal.

Dass sich die Leber asymmetrisch positioniert hängt mit dem lateralen Plattenmesoderm zusammen. Dieses wandert in der Regel so:

Es hänt, wie sollte es anders sein, mit dem Ephrin-Signalweg zusammen. Genauer gesagt EphrinB1 und EphB3b -siee steuern die Hepatboblasenpositionierung. Wenn wir durch Morpholinos EphrinB1 und Eph3b ausknocken und uns dann die Lebervorläuferzellen Prox1 anschauen sehen wir das:

Ein knockout des Liganden hat eien reduzierende Wirkung aber ein knockout des Rezeptors ephb3 osrgt für eine symmetrische Ausrichtung der Lebervorläuferzellen.

Dabei bilden die Hepatoblasen Zellfortsätze während der Knospung.

Und zwar verschiedene Arten:

Während Filopodien vorallem fürs Signalling verwendet werden (Noch Signalweg, Borstenvorläuferzellen), haben lamellipodien auch eine Transportfunktion.

Hier haben wir beides. Während Filopodien den Kontakt zwischen Heptaoblasten (also Lebervorläufer) und dem lateralen Plattenmesoderm herstellen, sorgen Lamellipodien für die entsprechende Verschiebung die letzlich die asymmettrische Leberpositionierung ausmacht.

Zellfortsätze haben also unterschiedliche Aufgaben:

Durch Fortsätze wie Filopodien kann ein Siganlling über weite Distanz erfolgen, um Zellen zu adressieren für eine spätere Fusion eignen sie sich ebenfalls.

Welche Rollen spielen nun EphrinB1 und EphB3b?

EphB3b kontrolliert die Orientierung der Lammelipodien. Eine hohe Epression von EphB3b im rechten LPM geht voraus.

Also zusammengefasst:

• Die Leber positioniert sich asymmetrisch

• sie tut das durch die Hilfe des LPM - aber die Leber wandert, nicht das LPM.

• Die Leber ist Endoderm, das LPM Mesoderm - wie der Name scon sagt

• Alsofindet ein Endoderm/Mesoderm-Kontakt statt

• Während in Hepatoblasten EphrinB1 exprimiert ist, finden wir den Rezeptor EphB3b im lateralen Plattenmesoderm

• EphB3b sorgt da dafür in welche Richtung sich die Zellfortsätze, welche sich aus den Lebervorläufern bilden, ausrichten.

• Lamellipodien in den Lebervorläufern sind dafür verantwortlich.

• Eine starke Expression von EphB3b im rechten LPM startet den Vorgang der Positionierung der Leberknospe.

Chat GPT fragen ob ich das richtig verstanden hab.

VORLESUNG 4: Zell-Zell-Kommunikation und links/rechts Asymmetrie der Organe - Ober - FRAGEN

1. Beantworte folgende Fragen:

1. Unterscheide parakrine und kontaktabhängige Signalübertragung und nenne je ein Beispiel.

2. Der Ephrin-Signalweg. Beantworte folgende Fragen:

   a. Wo kommt der Ephrin-Signalweg vor?

   Steuert mit in welche Richtung Axone aus der Netzhaut in welchen Teil des Gehirns wachsen

   b. Was ist der Ephrin-Signalweg für eine Art Übertragungsweg?

   juxtakrin, Kontaktabhängig

   c. Beschreibe die Signalweiterleitung grob

   Rezeptor und Ligand sind jeweils membrangebunden. Ephrine binden an Eph-Rezeptoren. Dabei binden in der Regel Ephrine A an EphA-Rezeptoren und Ephrine B an EphB Rezeptoren. Der Signalweg ist bidirektional.

   d. Auf der Netzhaut gibt es eine temporale und eine nasale Seite. In welche REgionen des Gehrns wachsen sie?

   Die nasale RGC-Axons wachsen in den posterioren Bereich, temporale in den anterioren Bereich.

   e. Beschreibe die EphA3 und die EphrinA2 Expression in Rentina und Tectum.

   EphA Expression hoch im temproalen Bereich der Retina. EphrinA2 Expression hoch im posterioren Teil des Tectums.

3. Beschreibe wie sich die Leber asymmetrisch bildet und welcher Signalweg dafür verantwortlich ist,

VORLESUNG 5: Blutgefäße im Gehirn - ZUSAMMENFASSUNG

Paper: Wnt/β-catenin signaling regulates VE-cadherin-mediated anastomosis of brain capillaries by counteracting S1pr1 signaling

Schon mal gehört? Blut/Hirn-Schranke? Das ist das dichteste Endothel das wir im Körper haben. Mehr dazu jetzt:

Die Bluthirnschranke - sie ist eine neurovaskuläre Einheit. Sie ist essentiell für die Homeostase im Gehirn. Was Homeostase ist wissen wir ja inzwischen. Wenn die Blut-Hirnschranke gestört ist, hat das viele Krankheiten zu Folge. Wir wissen ja, dass unser Immunsystem auf unser Gehirn keinen Zugriff hat. Wenn das so wäre, würden LEukozyten in unserem Gehirn Entzündungen auslösen und das wäre nicht so gut.

Auch der Zebrafisch hat eine Bluthirnschranke und exprimiert charakteristische Markergene. Die Bluthirnschranke wird im Zebrafischembryo nach erstaunlichen 2,5 Tagen dichter. Wir fragen uns - können wir was tun um die Blut-Hirn-Schranke aktiv öffnen und schließen zu können? Das wäre für die Therapie von Gehirntumoren interessant.

So bildet sich die Blut/Hirn-Schranke. So sieht es aus:

NAtürlich haben wir es hier wieder mit Signalwegen zu tun. Den Wnt-Signalweg kennen wir noch aus letzter Vorlesung: er spielte eine Rolle beim Leberwachstum (Wnt2bb…)

Welche Rolle spielt wnt bei der Entwicklung der Blut-Hirn-Schranke:

Nun schalten wir es aus, dann passiert das;

Es kommt zu vaskulären Defekten und Hirnblutungen - ähnliches passiert in der Maus. Wir erinnern uns an den Signalweg: wnt bindet an frizzled und löst den beta-catenin-Weg aus. Ohne wnt kommt es zum Abbau von beta-catenin:

Der wnt-Signalweg ist wärehnd der gesamten Hindbrain (Rautenhirn)-Angiogenese aktiv. Angiogenese = Blutgefäßbildung. Mit diesem Wissen können wir die Blut/Hirn-Schranke beeinflussen.

Wir könnten den wnt-Signalweg nciht ausknocken sondern inhibieren.

Und zwar durch einen Stoff namens IWR-1. Es sieht so aus:

Und bindet da dran:

Es stabilisert den Komplex, der dafür sorgt, dass trotz wnt-Signal beta Catenin abgebaut wird.

Auch genetisch lässt sich der wnt-Signalweg verhindern, durch eine Überexpression von dominant negativem DCF (dnDCF)

Es bindet am Zielgen und verhindert dessen Transkription, beta Catenin kann nicht binden.

Es sind noch viele Fragen offen. Wir kennen diesen Prozess und wissen dass der wnt-Signalweg während de rSpezifikation

für die Tipzell-Bildung wichtig ist. Aber hierüber wissen wir nichts.

Aber wir haben ja jetzt zwei potente Mögloichkeiten an die Hand bekommen den wnt-Signalweg zu manipulieren: durch IWR-1 und dnDCF. So haben wir herausgefunden:

• wnt ist nicht von Nöten für die Einwanderung (Invasion) der Central-Arterien ins Gehin. Siehste: rechts wie links - gleich. Allerdings, Achtung: Nicht von Nöten ERST NACH der Tipzellen-Spezifizierung

Hier. Wnt nicht nötig. Der nächste Schritt ist das Pathfinding und dann die Anastomose.

Schauen wir uns an was passiert wenn wir den wnt-Signalweg manipuilieren 48 hours post fertilization:

IWR-1 und dnTCF beeinflussen die Morphogenese der zentralen Arterien, aber Herzog geht nicht weiter darauf ein. Wichtiger:

Die zentralen Arterien haben kein Lumen. Hier siehst du die Prozent der Arterien mit Lumen, die durch IWR-1-Einfluss deutlich reduziert sind. Somit wissen wir - wnt ist wichtig für die Anastomose.

Und das hat was mit den Zell-Zell-Verbindungen zu tun:

Oh Claudine und Cadherine wo hast du das schon mal gehört…

RÜCKBLICK - STADTLER VORLESUNG GL1:

Zell- Zell Verbindungen.

Okay. Dann mache ich Mutanten, die sollen homozygot eine Mutation im Cadherin-Gen tragen:

Hier kommt es zu Zell-Zellkontakten aber nicht zu einem Lumen. Also auch zu einem schweren Anastomosedeffekt.

Was für einen Effekt hat das wnt/betacatenin-signaling auf die Lumenbildung?

Könnte die Transkription von Cadherinen z.b. von wnt/betacatenin gesteuert werden?

-> nein.

wnt/betacatenin ist notwendig für die Lokalisierung von Cadherinen in Zell-Zell-Kontakten im Zebrafisch.

Also was man hier auf jeden fall sieht - wenn ich den wnt/betacatenin Signalweg durch dn TCF blocke, dann habe ich kein Cadherin mehr. In der Maus hat man ähnliche Ergebnisse. Das hängt aber vom Entwicklungszeitpunkt der zelle ab. Bei Erwachsenen Tieren gilt dies nicht mehr.

Es gibt jedoch natürlich Player, die die Gene von Cadherin kontrollieren und einer davon heißt S1p. Mut uzr Lücke, ich merke mir nur dass wnt/betacatenin dem S1p entgegenwirkt durch S1pr1 und S1pr3.

Ein weiterer Player ist RAC1. RAC1 stabilisiert die Zell-Zell-Verbindungen. Für wnt/betacatenin in der Anastomose ist das nicht so gut, weil das ja die Zell-Zellverbindungen positioniert werden müssen. deswegen regelt wnt/betacatenin auch RAC1 runter. Wenn man jetzt RAC1 hochreguliert dann entsteht ein ähnlicher Phänotyp wie wenn wir wnt/betacatenin gehemmt hätten:

Wnt signaling hält s1p Expression niedrig durch Block von RAC1

VORLESUNG 5: Blutgefäße im Gehirn - FRAGEN

1. Der Wnt/beta-Catenin Signalweg spielt eine wichtige Rolle bei der Bildung der Blut/Hirn-Schranke. Nenne eine Methode wie man den Signalweg unterbrechen kann,

   a. pharmakologisch

   b. genetisch

2. Nenne die fünf Phasen der Hindbrain Angiogenese.

3. Wo genau ist wnt/betacatenin Signaling in der Angiogenese notwendig? Welche Phase? Wie sieht der Phänotyp aus?

4. Wie wirkt wnt/betacatenin auf Cadherin Gene?

VORLESUNG 6: Basics für Fragen- FRAGEN

KLAUSURRELEVANT

1. Wnt ist für Blutgefäßentwicklung nötig, deshalb würden Experimenten mit Knockouts oder Wnt-Signalweg ausschalten nicht funktionieren. 3 Experimente zum Testen vom Effekt von Wnt auf Blutgefäßentwicklung vorschlagen. (ALTKLAUSURFRAGE)

2. Wie wird der wnt/beta catenin Signalweg durch IWR-1 gehemmt?

3. Warum wird im transgenen Fisch tg(Axin2BAC:Venus-Pest) Axin adressiert und nicht z.B. betacatenin oder wnt?

4. Warum wird im transgenen Fisch tg(Axin2BAC:Venus-Pest) ein BAC verwendet?

5. Warum wird im transgenen Fisch tg(14xTCF:loxP-STOP-loxP-dGFP) eine loxPSTOPlox Kassette verwendet?

6. Wie erzeuge ich eine transgene Fischlinie?

7. Wie kommt es zu einer mosaiken Integration ins Genom?

8. Nenne Alternativen.

9. Erkläre morpholino-knockouts.

10. Wann ist nun wnt in der Angiogenese im Hindbrain aktiv und wann nicht?

11. Welchen Playern wirkt wnt/betacatenin entgegen und warum?

VORLESUNG 6: Basics für Fragen- ZUSAMMENFASSUNG

Paper: Wnt/β-catenin signaling regulates VE-cadherin-mediated anastomosis of brain capillaries by counteracting S1pr1 signaling

In der letzten Vorlesung haben wir einfach nochmal einiges durchgenommen, worauf sie großen Wert legt, dass wir wissen.

Als erstes schauen wir uns den Signalweg von wnt/betacatenin an:

Wichtig ist dass wir uns merken, dass wnt an Fz bindet, und dann einen Komplex auflöst der beta catenin bidnet. Wenn CRD am Rezeptor ist, ist betacatenin im Komplex und wird abgebaut. Löst sich der Komplex ist beta catenin frei und kann in den Zellkern. Dort wirkt es als Transkriptionsfaktor.

Der Signalweg kann durch zwei Wege geblockt werden: IWR1 (bindet an Axin) und dnTCF (blockirt die Bidnestelle für beta catenin). So. Wann ist wnt aktiv? Herzog reitet auf dieser Folie herum:

Was müssen wir darüber wissen? Mit einem normalen GFP-Reporter würde man wnt nicht erfassen, da wnt schon bei der Endoderm-Spezifikation eine Rolle spielt und GFP 12 Stunden lang anhält - es würde also überstrahlen.

Werfen wir mal einen Blick ins Paper:

“Die Behandlung mit dem Wnt-Signalinhibitor IWR-1 nach der Phase vor der Zellspezifikation führte zu schweren Gefäßdefekten und Blutungen im Gehirn, jedoch nicht in den Rumpfgefäßen (->)

-> was darauf hindeutet, dass während der Angiogenese des Gehirns weitere Anforderungen an die Wnt-Signalgebung bestehen. Wir haben daher mithilfe konfokaler Live-Bildgebung und zweier verschiedener transgener Wnt-Signalreporterlinien analysiert, in welchen Stadien der Angiogenese der Gehirnkapillaren eine aktive Wnt-Signalgebung beobachtet werden kann.

Diese Reporterlinien exprimieren kurzlebige Fluorophore, die durch Wnt-responsive Promotoren gesteuert werden:

Tg(axin2BAC:Venus-Pest) mu288

Tg(14TCF:loxP-STOP-loxP-dGFP) mu202 33 .

So aufgepasst ich hab den BUMS verstanden! Danke Chat GPT. Fangen wir mit der unteren transgenen Linie an:

Tg(14TCF:loxP-STOP-loxP-dGFP) mu202 33 .

Tg=Transgener Fischi.

TCF= 14x TCF sind 14 wiederholungen im Promotor von TCF/LEF Bindungsstellen. Diese Bindungsstellen sind die Zielsequenz von beta Catenin. Schau in die Abbildung.

Dann kommt die loxP-STOP-loxP Kasette. Das ist ein genetisches gängiges Werkzeug, entwickelt von DuPont (Cre/loxP System). Das STOP macht dass das Gen nicht abgelesen wird bis eine Cre-Rekombinase kommt, die spezifisch loxP-STOP-loxP ausschneidet. Deswegen wird immer auch cre m-RNA benötigt.

Cre schneidet dann in den Zellen in denen wnt aktiv ist loxSTOPlox aus und dGFP wird exprimiert und leuchtet grün. Warum kein normaler GFP-REporteR? Weil wnt schon bei Endothelspezifiaktion eine Rolle spielt und GFP 12 Stunden aktiv bleibt.

Zweite transgene Linie:

Tg(axin2BAC:Venus-Pest) mu288

Transgen mit einem Bacterial Art Chromosome. Das wurde so verändert, dass das Gen welches Axin kodiert, so verändert wurde, dass es stattdessen für Venus-Pest - einem gelben Fluorochrom, was schnell abgebaut wird durch die PEST Sequenz kodiert- dabei wird nicht das endogene Axin ersetzt, sondern nur wnt abhängiges Axin sichtbar gemacht. In dem BAC sind weiter alle regulatorischen Elemente für Axin enthalten (Promotor, Enhancer ect).

Wie wird so ein transgener Fisch erzeugt?

Ich injiziere ein Konstrukt mit meinem Zielgen (z.b. Promotor zielgen marker) flankiert von Tol2-Erkennungssequenzen sowie mRNA für tol2 Transposase in den Embryo, sowird das Konstrukt von der tol3 Transposase in das Genom integriert - jedoch mosaik. Also nicht alle Zellen tragen das Zielgen im Genom. Die mosaiken F0-Fische werden dann großgezogen, und mit dem Wildtyp gekreuzt. Wurde die Keimbahn getroffen, vererbt der Fisch das verädnerte Genom weiter und wir haben einen echten trangenen FISCHI!

NACHARBEITEN:

• recherchieren wie ein Screen genau funktioniert in dem zufallsmutationen im genom eingefügt werden und dann Gliegenembryonen unterm Mirksokop