Tag 1: A. thaliana

-Signifikanz wird bei der Darstellung wissenschaftlicher Daten genutzt, um einen statistisch-bedeutungsvollen Unterschied zweier Gruppe an Daten, meist eine Kontrollgruppe, erkenntlich zu machen und so eine zufällige Beobachtungen auszuschließen. Eine Hypothese kann so bestätitgt oder untermauert werden.

-Die verschiedenen Signifkanzstufen werden wie folgt gekennzeichnet:

0,05 ≤ p => zufällige Beobachtung, kein Beleg für Effekt

*signifikant (p<0,05)

**hoch signifikant (p<0,01)

***Höchst signifikant (p<0,001)

Mit p als Wahrscheinlichkeit dafür, dass der beobachtete Effekt zufällig ist.

-Signifkanz ist stark abhängig von den Einzelwerten einer Messreihe weil diese sowohl Streuung, Gruppenmittelwerte und auch Stichprobengröße beeinflussen.

=> je kleiner die Streuung/Varianz, desto einfacher sind nicht-/signifkante Unterschiede festzustellen

=> je weiter die Gruppenmittelwerte auseinander liegen, desto höher die Wahrscheinlichkeit für einen signifkanten Unterschied

=> je größer die Stichprobengröße n, desto “stabiler” der Mittelwert und desto einfacher, einen signifikanten Unterschied nachzuweisen

• Entwicklungsmodus: Tiere = embryonal, Pflanzen = postembryonal, dh. kontinuirliche Organbildung => Beobachtung der Pflanze beim Wachsen + Beobachtung z. B. von Xenopus Embryonen bei der Entwicklung

  => kontinuierliche Organbildung bei Pflanzen ≠ höhere Tiere: Ablationsexperimente bei Pflanze

• plastische Entwicklung: Pflanzen verfügen aufgrund ihrer fehlenden Möglichkeit des Positionswechsel über deutlich sensiblere und schnellere Anpassungsmöglichkeit. Beispiel: Photomorphogenese bei Arabidopsis Keimlinge kann mithilfe von unterschiedlichen Lichtbedingungen (Dunkelheit, Rotlich, Blaulicht, Weißlicht) veranschaulicht werden

• Position (nicht Abstammung) entscheidet über Zellschicksal => Reportergen/Promotorkonstrukt das Färbung bei Aktivität des Promotors freisetzt und zeigt, welche Zellen für was verantwortlich sind

• Zellwanderung: Tiere erzielen ihre Formbildung oft durch Zellwanderung während Pflanzen dies durch Zellstreckung tun. => Bei Frosch-Embryonen kann man Zellwanderung z. B. durch Mikroskopie während der Gastrulation beobachten, Pflanzenzellen kann man durch radiaoktive Marker verfolgen.

Photorezeptoren perzipieren photomorphogenetisch wirksames Licht:

• Phytochrome perzipieren Rotlicht. Sie werden im Dunklen synthetisiert (Pr-Form) und akkumulieren dann im Cytoplasma. Bei Licht absorption kommt es zur Aktivierung der Pr => Pfr-Form und es findet ein Transport in den Zellkern statt. Die aktive Pfr-Form interagiert hier direkt mit Transkription und steuert so lichtregulierte Gene.

  => Aufgabe: Informationen über Lichtqualität, Lichtquantität und Temperatur

• Cryptochrome perzipieren Blaulicht. Sie sind Flavoprteine, also Proteine mit FAD als Cofaktor und liegen im Zellkern von Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen vor. Blaulicht angeregtes Cryptochrom mit reduzierten FADH kann auch gelbes + grünes Licht absorbieren.

  => Aufgabe: Photomorphogenese und circadiane Uhr steuern

• Phototropine sind ebenfalls Blaulichtrezeptoren und außerdem Serin-Threonin-Rezeptorkinasen. In Dunkelheit assoziieren sie in der Plasmamembran und gehen bei Beleuchtung ins Cytoplasma über.

  => Aufgabe: Photosynthese Optimierung durch Steuerung Phototropismus

• Wildtyp vs. Cry1/2:

  -Rotlicht + Dunkelheit gleiche Hypokotyllängen

  -Blaulicht: Mutante 4x so langes Hypokotyl, Wachstum wie in Dunkelheit (fehlende Cryptochrome, die kein photomorphogenetisch wirksames Licht perzipieren können)

  -Weißlicht: Mutante 2x so lang, enthält Blauanteile auf das Keimling wegen fehlender Cryptochrom-Rezeptoren nicht mit Photomorphogenese Entwicklung reagieren kann. Wächst zum Licht hin weil Phototropine Photosynthese optimieren + Phototropismus steuert.

• Wildtyp vs. Phot1/2

  -Rotlicht + Dunkelheit gleiche Hypokotyllängen

  -Blaulicht: Mutante 3,5x so lange, keine Photosynthese-Optimierung aufgrund fehlender Phototropin-rezeptoren => Keimlinge wachsen von Licht weg, aber gehemmtes Streckenwachstum durch anwesende Cryptochrom Rezeptoren (=> Phtomorphogenese)

  -Weißlicht: Mutante ähnlich lang wie WT wegen Cryptochrome.

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Hypokotyllängen gemittelt:

• Wildtyp: ähnliches Wachstum bei Weiß- und Blaulicht, (=Phtotropismus + Photomorphogenese) Rotlicht gezogene Keimlinge wahrscheinlich größer aufgrund von Schatten => Information, die Cryptochrome durch verhältnis FR : LFR bestimmen und Pflanzen sich so ggf anpassen können. Dunkelheit: kaum Licht, Skotomorphogenese mit gestrecktem Hypokotyl.

• Cry1/2 Mutante: da keine Cryptochrom Rezeptoren => insensitiv gegenüber blauem Licht, verhalten sich deswegen wie in der Dunkelheit, sonst würde Streckenwachstum gehemmt werden. Weißlicht-gezogene Keimlinge (mit Anteilen Blaulicht) reagieren deswegen eher so wie Rotlicht-gezogene, weil sie fast nur rotes Licht verwenden können.

• Phot1/2 Mutante: Phototropinrezeptoren fehlen, insensitiv gegenüber blauem Licht. Photosynthese kann nicht richtig optimiert werden, Keimlinge wachsen entgegen Richtung des Lichts. Der Rest wächst wie im Wildtyp. Unterschied in Wuchsausrichtung, nicht in Hypokotyllängen.

• PhyA/B Mutante: fehlende Phytochromrezeptoren, d. h. keine Möglichkeit zum perzipieren von photomorphogenetisch wirksamen Licht bei Rotlicht. Kiemlinge wachsen wie im Dunkeln, da keine Informationen über Verhältnis LFR : FR wie Schattenverhältnisse ermittelt werden kann. Weißlicht enthält auch Anteile rot, deswegen auch hier gestrecktes Wachstum

• Keimlinge als Wildtyp, Cry1/2, Phot1/2 und PhyAB Mutanten, gezogen alle jeweils einmal in Weißlicht, Rotlicht, Blaulicht, Dunkelheit und einer mit Punktförmiger Lichtquelle.

• Den Mutanten fehlen jeweils ein wichtiger Photorezeptor Komplex, der sich durch photomorphogenetische Störungen geäußert hat und im Vergleich zum Wildtyp gut erkennbar war. Die Hypokotyllänge hat dabei das Hauptaugenmerkmal hergegeben.

• Cryptochrom1/2 Mutanten => Blaulicht (+ Weißlicht): fehlende Photomorphogenese Entwicklung, keine Hemmung im Streckenwachstum

  => wächst aber in Richtung Licht weil Blaulicht von Phototropin Rezeptoren noch zur Photosynthese Optimierung verwendet werden kann.

• Phototropin1/2 Mutanten

  => überall gehemmtes Streckenwachstum aufgrund der Cryptochrome die noch Blaulicht perzipieren können

  => aber keine Photosynthese Optimierung durch Phototropismus, Keimlinge wachsen von Lichtquelle weg

• PhytochromAB Mutanten

  => Weiß- und Rotlicht: Hypokotylwachstum da keine Information über Schatten-/Lichtverhältnisse.

• Wildtyp: entspricht dem klassichen ABC-Model aus 4 Wirteln mit 3 Identitätsorgan-Genen:

  -A-Gene: Sepale/Petale

  -B- Gene: Petale/Stamina

  -C-Gene: Stamina/Staubblätter, Fruchtblätter/Karpelle (Geschlechtsorgane)

• Agamous-Mutante: C- Genotyp

  -fehlendes C-Gen, Pleiotropie des C-Gens => limitierender Faktor in Organanzahl fehlt, nur Platz limitiert Anzahl

  -Antagonismus A-Gen

  -Sepale, Petale, Petale, Sepale

• Pistillata-Mutante (Apetala-3): B-Genotyp

  -fehlendes B-Gen, nur A- und C- Gen

  -Sepale, Sepale, Karpelle, Karpelle

1) Wildtyp

2) Apetala 1/2 knockout (A-Genotyp)

3) Pistillata Knockout (B-Genotyp)

4) Apetala1/2-pistillata-agamous Knockout (ABC- Genotyp)

-nur Laubblätter, keien Blütenoranidentitätsgene

• Wildtyp

  -A-Gene: Sepale/Petale

  -B-Gene: Petale/Stamen

  -C-Gene: Stamen/Karpelle

• Apetala2/Pistillata: A-, B- Genotyp

  -zu sehen: außen Laubblätter (=> keine Blütenidentität), keine Sepale, keine Petale, keine Stamina, nur Karpelle im 4. Wirtel

  -ABC Modell Vorhersage: Karpelle - Karpelle - Karpelle - Karpelle da nur C-Gen aktiv + auch nicht B anwesend ist um Stamina zu kodieren

• Auffälligkeit: -überraschender Weise keine Karpelle im 1. - 3. Wirtel trotz Antagonismus A- C Gene, weißt auf Pleiotropie (= weitere Funktionen als nur die von Blütenorganidentitästgenen) des C-Gens hin

  =>limitierende Funktion in Anzahl der Blütenorgane

  
  

• Wildtyp:

  1. Wirtel: Sepale (Kelchblätter)

  2. Wirtel: Petale (Kronblätter)

  3. Wirtel: Stamen (Staubblätter)

  4. Wirtel: Carpel (Fruchtblätter)

1) Apetala (A- Genotyp), Karpelle, Stamina, Stamina, Karpelle => GAAG

2) Pistillata (B- Genotyp): Sepale, Sepale, Karpelle, Karpelle

=> KKGG

3) Agamous (C- Genotyp): Sepale, Petale, Petale, Sepale

=> (KCCK)∞

=> Agamous-Gen kodiert für Staub/Stamina- und Fruchtblättern/Karpelle (= Geschlechtsorgane)

1) Wildtyp: Blaufärbung in Staub- und Fruchtblättern (3. + 4. Wirtel)

2) Apetala1/2 Knockout:

-A-Funktion/Gen fehlt => Antagonistische Wirkung von C

-Blaufärbung in allen Wirteln (1.-4.)

3) Pistillata Knockout/Apetala 3: B- Genotyp, B-Funktion fehlt

-Wirtel: Sepale, Sepale, Karpelle, Karpelle

-Expression: 3. + 4. Wirtel (Karpelle/ Fruchtblätter)

4) Apetala1/2-pistillata-agamous Knockout: ABC- Mutante

-nur Laubblätter, keine Blütenorganidentitätsgene => keine Blütenidentität

-Bei der Agamous Mutante fehlen die C-Organidentitätsgene, die sonst als Transkriptionsfaktor den inneren Blütenwirtel kontrolliert.

-Da die A und C-gene antagonistisch aufeinander wirken, kommt es bei Aufall der C-Gene zur Expression der A-Gene an ihrer Stelle. Aus diesem Grund sind außschließlich Sepale und Petale zu sehen.

-Auffälligkeit: die Petale häufen sich im Inneren. Das weißt auf Pleiotropie, also weitere Funktionen als nur die von Blütenorganidentitästgenen, des fehldenden Gen C hin. Das bedeutet das Gen C bei Anwesenheit einen limitierenden Faktor auf die Blütenorgane besitzt, die von Gen A und B gebildet werden. Ohne diese Limitierung ist die Anzahl der Organe nur über verfügbaren Platz bedingt.

-Wuschel wirkt nur im Sprossapikalmeristem um dort die Induktion und Erhaltung von Stammzellzentren zu gewährleisten

-reguliert Stammzellnische, Zellgruppe unterhalb von Stammzellzentren

-SAM ist in etiolierten (dunkelheit) Pflanzen nicht aktiv, deswegen auch keine Genexpression

• Wuschel Funktion: reguliert Stammzellnische (Zellgruppe unterhalb Stammzellzentren) um Induktion + Erhaltung von Stammzellzentren im Sprossapikalmeristem

• Agamous Gen: kodiert für Staub- und Fruchtblätter (Geschlechtsorgane) zur Reproduktion

• Photosynthese Abwesenheit: Stammzellzentrum nicht aktiv

=> Erklärung Agamous: WUS sorgt für Zellproliferation und Organbildung. Es wird später von einem Repressor unterdrückt damit Agamous Gene dann legt Identität der reproduktiven Organe (Staub- und Fruchtblätter) festlegen kann.

=> Erklärung Photosynthese: Wuschel reguliert die Stammzellnische zur Induktion + Erhaltung der Stammzellzentren im SAM. Bei Photosyntheseabwesenheit ist das Stammzellzentrum allerdings nicht aktiv sodass Wuschel kaum exprimiert wird.

• Blaufärbung in photosynthetisch aktivem Gewebe in Blättern und Kotyledonen

  => nur in deetiolierten keimlingen logischerweise, da diese keine Chloroplasten -> kein Chlorophyll sondern nur Etioplasten besitzen

• LHCB Funktion: Promotor für ein Chlorophyll a/b bindendes Protein im FSII

  -Bildung FSII stark lichtabhängig durch Aktivierung Phytochromsignaltransduktion

  -LHCB Expression stark konserviert

1. Grundlegend: Wir führen eine sogenannte Genexpressionsanalyse durch um das Expressionsmuster eines Gens zu erhalten. Wir wollen also wissen, in welchem Gewebe des Pflanzenkeimlings und ggf. auch zu welchem Zeitpunkt der Entwicklung (=>Beispiel CHS) das Gen exprimiert wird und daraus zu schlussfolgern, was mögliche Eigenschaften und Funktionen des Gens sein könnten.

2. Fusion: wir nutzen das Enzym ß-Glucuronidase (GUS) als Reportergen und fusionieren dies mit einem Promotor des gefragten Gens. Ggf. werden noch anderen regulatorischen Sequenzen fusioniert.

3. Einbringen in die Zelle: Das Reportergen-Promotor-Konstrukt wird mithilfe Agrobacterium Tumefaciens durch Transformation, also freie DNA-Aufnahme, in die Zellen der Pflanzenkeimlinge eingebracht. Die DNA wird in das Pflanzengenom fest und stabil integriert.

4. Reaktion: ist der Promotor aktiv spaltetet, wird unser Reportergen GUS exprimiert und spaltet enzymatisch X-Glc. Dabei setzt es eine wasserunlösliche Indigoblau-Färbung frei und zeigt, in welchen Geweben und Zellen das gesuchte Gen exprimiert wird.

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• Umschalten Skotomorphogenese => Photomorphogenese: photomoprphogenetische Veränderungen = durch Licht eingesetzte Gestaltsentwicklung einer Pflanze

• differentielle Genexpression: Molekulare Ebene der photomorphogenetischen Veränderungen, gezieltes An- und Abschalten von Genen damit Zellen eine bestimmte Aufgabe/Funktion annehmen können

• Genexpressionsmuster: Lokalisierung aktiver Gene um auf ihre Funktion schlussfolgeren zu können

• Genexpressionsanalyse: Technik um Expressionsmuster zu ermitteln

• WUS: keine Färbung im etiolierten Keimling

  -reguliert Stammzellnische zur Induktion + Erhaltung der Stammzellen im SAM

  -SAM in etiolierten Keimlingen nicht aktiv => kaum/keine Exprimierung von WUS-Transkriptionsfaktor

  
  

• CHS: keine Färbung im etiolierten Keimling

  -Chalconsynthase katalysiert Flavonoidsynthese im Sekundärstoffwechsel, die nur in älteren Zellen (im äußeren Blatt) mit laufendem Primärstoffwechsel statt findet

  -etiolierte Keimlinge unterentwickelte Kotyledonen + katabolen Stoffwechsel, Sekundärstoffwechsel nicht möglich

  
  

• 35S/CaMV: vollständige Färbung im etiolierten Keimling

  -Promotor für Transkription des viralen Gesamtgenoms, wird als positiv Kontrolle genutzt und sowohl in etiolierten als auch deetiolierten Keimlingen in allen organen exprimiert

  => unabhängig von Pflanzeneigenschaften wie Stoffwechsel, Photosynthese etc.

  
  

• ARR5: (keine?) Färbung im Wurzel des etiolierten Keimling

  -Promotor für Cytokinin Gen = Hormon zur Zellprolifertaion in Apikalmeristemen

  -im Dunklen nur Streckungswachstum, keine Zellteilung!

• LHCB: keine Färbung im etiolierten Keimling

  -LHCB Gen kodiert für ein Chlorophyll a/b bindendes Protein im FSII dass nur lichtabhängig gebildet wird und deswegen auch nur in photosynthetisch aktivem Gewebe gebildet wird

  => im Dunklen keine Fotosynthese!

• CYCB1: keine Färbung im etiolierten Keimling

  -Cyclin B1 Gen reguliert in der Wurzelspitze die Zellteilung in deetiolierten Keimlingen

  -keine Zellteilung im Dunklen, nur Streckungswachstum