Nennen Sie alle Proteine aus der Vorlesung, die GTP hydrolysieren. An welchem Prozess sind diese jeweils beteiligt bzw. welche Funktion haben sie?
Tem1 (kleine GTPase) löst FEAR und MEN aus, die zu Cdc14 Aktivierung und Mitoseaustritt führen
Ran (kleine GTPase) steuert nukleozytoplasmatischen Transport und Chromosomen-abhängige Spindelbildung, indem es die Bildung von Importin und Exportin an NLS- bzw. NES-Proteine reguliert
Ras (kleine GTPase) an Signaltransduktion von Mitogenen beteiligt; von Onkogen kodiert
Rho (GTPase) an Zytokinese beteiligt
beta-Tubulin —> dynamische Instabilität von Mikrotubuli —> Spindelbildung unter anderem Zytoskelettfunktion
a) Was passiert, wenn sie Shugosin 1 in humanen Zellen mittels RNAi depletieren? Erklären sie knapp.
b) Warum kann man die Effekte der Sgo1-Depletion durch Gabe von ICRF-193, einem Inhibitor von Tropoisomerase 2, weitgehend unterdrücken?
c) schlagen sie eine zu b) alternative Behandlung vor, durch die sich die Effekte der Sgo1-Depletion ebenfalls unterdrücken lassen!
a) frühzeitige Trennung der Schwesterchromatiden, da auch zentromerisches Cohesin durch Prophaseweg deplaziert wird
b) Schwesterchromatide sind nach der Replikation miteinader verwunden: diese Katenierung muss von Topo2 aufgelöst werden, bevor Anaphase stattfinden kann
c) Prophaseweg inhibieren, z.B. RNAi von Wapl
Zählen Sie alle Ihnen bekannten APC/C Substrate auf und nennen Sie stichpunktartig deren jeweiloge Funktion bzw. Aktivität
Securin: Separaseinhibitor
Cyclin B: aktive regulatorische Untereinheit von Cdk1 (auch Cyclin A)
xkid: an Kogression beteiligtes Chromokinesin
Geminin: Antagonist des preRC, verhindert unzeitgemäße Relizensierung und somit Überreplikation
Cdc20: Co-Faktor des APC/C in Mitose
UbcH: E2 für APC/C
Sie vermuten, dass sich die repetitive DNA im rDNA-Lokus von S. cerevisiae nach anderen “Regeln” trennt, als das restliche Genom. Mit welchen Techniken (Stichworte genügen) könnten sie selektiv die Trennung der rDNA-Region in a) fixieren und b) lebenden Hefezellen lichtmikroskopisch sichtbar machen?
a) FISH, dafür müssen die Zellen aber fixiert werden -> nicht dynamisch
b) lacO-array nahe rDNA-Lokus genomisch integrieren + LacI-GFP exprimieren
c) state-of-art: rDNA-specific rRNA + dCas9-GFP
a) Was ist ein CKI? Welche Klassen und Vertreter von CKIs haben Sie kennengelernt und wie unterscheiden sie sich in ihrer Wirkweise?
b) p16^INK4A ist in mehr und in agressiven Tumoren mutiert als das nah verwandte p15^INK4B. Welcher besondere genetische Umstand ist hierfür verantwortlich?
c) Wofür steht pRB und woher resultiert der Name? Was macht es und wie wird es reguliert?
a)
Cdk1 Inhibitor
p15INK4B, p16INK4A : binden Cdk und verhindern Cyclinbindung kompetitiv
p21Cip1, p27Kip1, S.c.Sic1 : binden Cyclin-Cdk-Komplex und blockieren aktives Zentrum (verhindern ATP-Bindung)
b)
p16 Gen überlappt mit ARF (alternative reading frame) = Antagonist von Mdm2 -> p53 Stabilisierung -> ergo: ARF ist wie p16 auch ein Tumor-Supressor
c)
Retinoblastoma
homozygoter Ausfall führt zu Tumoren in der Netzhaut, bindet und inhibiert E2F-Transkriptionsfaktor und inhibiert so G1>S Übergang, wird durch Phosphorylierung (Cdk4-Cyclin D) inaktiviert
Sie haben ein neues Spindel-assoziertes Protein identifiziert
a) Wie können sie experimentell testen, ob ihr Protein, dass Sie in E.coli exprimiert und dann gereinigt haben, direkt an Mikrotubuli bindet?
b) Angenommen, ihr Protein bindet tatsächlich direkt an Mikrotubuli, wie können Sie dann im nächsten Schritt testen, ob es sich um ein Motorprotein handelt?
MT-Pelletierungsassay, dazu gereinigtes Tubulin in vitro polymerisieren, …
(Rhodamin-markierte, Taxol-stabilisierte MTs auf Objektträger immobilisieren —> colokalisiert Protein (IF oder GFP-Fusion)
b) Protein auf Objektträger immobilisieren -> Rhodamin-markierte, Taxol-stabilsierte MTs dazu -> wandern diese in Abhängigkeit von ATP-Zugabe?
Bildung von MT-Astern in zellfreien, mitotischen/meiotischen Ei-Extrakten, die mit fluoreszenzmarkierten Tubulin versetzt wurden.
a) MTOC-abhängige MT-Bildung benötigt den gammaTURC. Wie würden Sie experimentell überprüfen, ob die Chromosomen-abhängige MT-Bildung im Xenopus-Eiextrakt System ebenfalls von gamma Tubulin abhängt?
a) Immunodepletion (& idealerweise add-back) und dann Spermienkerne (oder einfach DNA-beads) zugeben
Wahr oder Falsch (falsche Antworte ergeben Punktabzüge)
Nach der prämeiotischen S-Phase finden sich im menschlichen Zellkern 92 DNA-Doppelstränge.
Menschliche Spermien enthalten in ihren Zellkernen 23 DNA-Doppelstränge
Persistierende Kohäsion der Schwesterchromatide im Bereich ihrer Centromere ist eine Besonderheit von Meiose I
Nennen sie zwei Gründe, warum das rechte Chr. keine Ahnung von Mitose hat?
Bilder unterschiedlicher Stadien der M-Phase, diese zuordnen
a) Wie viele Kinetochore und wieviele Zentriolen enthält eine humane somatische Zelle in der Mitose?
b) Wieviele Telomere enthält ein menschliches Spermium?
c) Beschriften Sie die untenstehende Abbildung
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