1.0. Was versteht man unter den „drei Farben der Biotechnologie“?
What is usually understood by the “three colours of biotechnology”?
Was ist ein Blockbuster in der pharmazeutischen Industrie?
What is a blockbuster in the pharmaceutical industry?
1.0.3. Was ist die Bedeutung von API? What is the meaning of API abbreviation in biopharmaceutical industry?
= Ein Produkt, das jährlich einen Umsatz von mehr als 1 Milliarde US-Dollar generiert.
1.0.3. Was ist die Bedeutung von API?
= Active Pharmaceutical Ingredient (active substance)
= is the end formulated product after USP & DSP & Formulation
1.0.2. Nennen Sie 3 Produkte der weißen Biotechnologie und 3 der roten Biotechnologie. Warum sind Produkte der weißen Biotechnologie so viel billiger als Produkte der roten Biotechnologie?
Name 3 products of white biotechnology and 3 of red biotechnology. Why are products of white biotechnology so much cheaper than products of red biotechnology?
1.1. Welche Eigenschaften von Aminosäuren können zur Trennung von Peptiden & Proteinen verwendet werden?
Which properties of amino acids in proteins can be used for the separation of peptides and proteins?
HIC = hydrophobe Interaktionschromatographie = trennt Proteine nach ihrer hydrophoben Oberfläche
= je hydrophober ein Protein, desto stärker bindet es an die hydrophobe stationäre Phase -> hydrophile Proteine binden wenig/ gar nicht
=> Elution erfolgt dadurch, dass Salzkonzentration verringert wird -> mehr freie Wassermoleküle -> schwächere Bindung an stat. Phase
-> Proteine eluieren in Reihenfolge ihrer Hydrophobizität: wenig hydrophobe zuerst, stark hydrophobe später -> chromatogramm
1.2. Welche grundlegenden Typen biotechnologischer Produkte kennen Sie? Nennen Sie bitte 3 Beispiele.
Which different classes/ types of biopolymers do you know as biotechnological products? Please give three examples.
1.3. Beschreiben sie kurz was die Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur eines Proteins ist? - klausurrelevant!
Describe briefly what is the primary, secondary, tertiary and quaternary structure of a protein?
1.4. Nennen sie die 2 wichtigsten Hauptstrukturelemente der Protein-Sekundärstruktur. Was verbindet sie? - klausurrelevant!
Wie bezeichnet man die strukturell weniger definierte, flexiblere Verbindung zwischen solchen Hauptstrukturelementen? Name the two main structural elements of protein secondary structure. What connects them?
Loops & Turns verbinden a-Helix und ß–Faltblatt und ermöglichen räumliche Faltung des Proteins.
Loops verbinden z.B. a-Helix mit ß–Faltblatt oder 2 a–Helices oder 2 ß–Stränge
Turns verbinden meist 2 benachbarte ß–Stränge
1.5. Was muss bei der Aufreinigung von Proteinen, RNA, DNA oder Viren ganz allgemein bei der Auswahl der Reinigungsmethoden beachtet werden, damit die Wirkstoffe pharmakologisch wirksam sind?
When purifying proteins, RNA, DNA or viruses in general, what has to be taken into account when selecting purification methods to ensure their function as active substances?
1.6. Welche Schwierigkeiten sind bei der Aufreinigung von globulären und fibrillären Proteinen zu erwarten? - klausurrelevant!
What are the difficulties in the purification of globular and fibrillar proteins?
Globuläre Proteine = kugelförmig, kompakt gefaltete Proteine, meist wasserlöslich (hydrophil) & funktionell aktiv z.B. Enzyme, AKs, Hämoglobin
Fibrilläre Proteine = längliche, faserartige Proteine, meist wasserunlöslich (hydrophob) & strukturell stabil z.B. Kollagen, Keratin, Myosin
1.7. Wodurch entstehen bei biotechnologischen Produktion unvermeidbare Mikroheterogenitäten in Proteinen ( mAK) ? Nennen Sie 2 Bsp.
What causes microheterogeneities in proteins (e.g. MAK) during biotechnological production? Give 2 examples. - klausurrelevant!
Wichtige Inhalte aus Skript 1 - Stoll
1.8. Wie können gereinigte mAK in der Qualitätskontrolle (QC) analysiert werden ? Nennen sie stichwortartig Beispiele für Analysenmethoden (keine Detailbeschreibung erforderlich). - klausurrelevant!
How can purified mAK be analysed in quality control (QC)?
= mit, SDS-PAGE, Enzymspaltung, Peptidmapping (mit Trypsin), HPLC, Massenspektrometrie
SDS-PAGE = Trennung von Proteinen nach ihrer Molekülgröße (Molekulargewicht) unter Verwendung eines denaturierenden Detergens (SDS) im Polyacrylamid-Gel.
SDS = anionisches (-) Detergens, lagert negative Ladungen ums Protein -> alle Proteine bekommen negative Nettoladung proportional zur Länge & Masse!
=> Trennung nur nach negativer Ladung, ursprüngliche Form + Ladung irrelevant!
Im Gel: anlegen von Spannung -> nrgativ geladene Proteine wandern zur Anode (+Pol) -> durch Poren (Siebprinzip) wandern kleine Proteine schneller + weiter & große Proteine bleiben “hängen”, wandern langsamer durch Gel.
HPLC = High Performance Liquid Chromatography = Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie = trennt Proteine in flüssiger Probe durch ihre chem. Wechselwirkungen mit stat. Phase beim hohen Druck (100-400bar)
-> Probe fließt in mobiler Phase unter hohen Druck -> Probenbestandteile gehen WW mit stat. Phase (aus Silicagel + Beschichtung) ein
=> starke WW = stärkere Bindung an stat. Phase & verzögerte Elution, späteres Signal im Detektor -> späterer Peak
=> schwache WW = schwache Bindung an stat. Phase & schnellere Elution, früherer Signal im Detektor -> früherer Peak
=> Je stärker die Retention, desto längerdie Verweilzeit
Massenspektrometrie (MS) = wandelt Proteine/ Moleküle in geladene Teilchen (Ionen) um, trennt sie nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) & Detektion erfolgt im Massenspektrum.
-> Protein wird ionisiert (in geladenes Ion überführt) -> Ionen werden im elektrischen/ magnetischen Feld beschleunigt & nach m/z-Verhältnis getrennt: leichte Ionen (kleine Masse) = schneller / schwerer Ionen (hohe Masse) = langsamer
-> Detektion - Massenspektrum: zeigt im Diagramm welche Ionen/Proteine in Probe vorhanden sind & dessen Menge (= je höher Peak, desto mehr davon in Probe)!
1.9. Welche Eigenschaften von Proteinen, DNA und Viren können für deren Aufreinigung verwendet werden? - klausurrelevant!
Which properties of proteins, DNA and viruses can be used for their purification?
Im DSP (Aufreinigung) nutzt man unterschiedliche biophysikalische Eigenschaften von Biomolekülen – wie Größe (hydrodynamisches Volumen), Ladung, Hydrophobizität, Chelatbildung und Bindungsspezifität (Affinität) –, um sie gezielt zu trennen und aufzureinigen.
Antwort von Stoll:
1.10. Wodurch können Proteinverunreinigungen in DNA-Präparation entstehen?
- klausurrelevant!
What can cause protein impurities in DNA preparations?
DNA besitzt eine negative Ladung und kann dadurch elektrostatisch positiv geladene Proteine binden – ähnlich wie ein Anionentauscher.
Diese unspezifischen Bindungen führen zu Proteinverunreinigungen, wenn sie nicht z. B. mit hochsalzigen Puffern gezielt gelöst werden.
1.11. Warum ist der Begriff „Biogenerikum“ irreführend und wird deshalb nicht für Nachahmerprodukte von Biologika verwendet?
Welcher Begriff wird stattdessen verwendet?
Why is the term "biogeneric" misleading? - klausurrelevant!
1.12. Welche Unterschiede gelten für Zulassung von Biosimilars und Generika?
What are the differences between biosimilars and generics? - Siehe Aufg. 1.11
1.13. Warum sind biotechnologische Produkte nicht mit 100 % Reinheit herstellbar? - klausurrelevant!
Why are biotechnological products not producible with 100 % purity?
1.14. Warum können Viren an Ionenaustauschern bei pH-Werten getrennt werden, die dem pI-Wert ihrer Oberflächenproteine entsprechen ?
– schwierige Frage klausurrelevant! Bonusfrage
Why can viruses be separated on Ion-exchangers at pH values corresponding to the pI value of their surface proteins?
Wichtig: in IEC/ IEX = Austauscher ist entgegengesetzt geladen zum Ion, das er bindet!
1.15. Warum ist die Bindekapazität von Ionenaustauschern für Viren und Plasmide (DNA) geringer als für Proteine ? – schwierige Frage - klausurrelevant!
Why is the binding capacity of ion exchangers for viruses and plasmids (DNA) lower than for proteins?
1.16. Was bedeutet das Kürzel DSP in der Biotechnologie?
What does the abbreviation DSP mean in biotechnology? - klausurrelevant!
DSP = Downstream Processing = Sammelbegriff für alle Prozessschritte zur Aufreinigung eines biotechnologisch hergestellten Moleküls (biologic)
Wichtig: Nach DSP folgt die (biotech.) Formulierung = umfasst NUR die Stabilisierung & Lagerfähigkeit von API. Es beinhaltet NICHT die galenische Arzneimittelherstellung!! Diese folgt nach der Bioprozesskette
Formulierung nach DSP = NUR lagerfähiger Wirkstoff (Herstellung techn. Stabilitästform), KEIN versbreichungsfertiges Arzneimittel!!
Kritische Verunreinigungen = Beeinträchtigen Herstellungsprozess oder die Produktqualität → Wirtszellen/ Wirts-DNA / Endotoxine
1. Können Stabilität, Wirksamkeit oder Reinheit des Produkts mindern
2. Können Analytik stören
3. Wirken evtl. immunogen oder pyrogen, aber meist nicht infektiös
Pathogene Verunreinigungen = Können beim Patienten Infektionen oder Krankheiten auslösen → Viren/ Bakterien/ Prionen
1. Direkte Gefahr für die Patientensicherheit
2. Können lebensbedrohlich sein
1.17. Welche Arbeitsschritte umfasst das Downstream Processing? Was steht am Ende des Downstream Processings, wie bezeichnet man das Endprodukt des DSP? - klausurrelevant!
What steps does downstream processing involve? What is at the end of downstream processing, what is the endproduct of the DSP?
Recovery = Rohstofffreisetzung aus Ferment
1.18. Nennen Sie die 4 Haupttypen an Biologicals. Nennen Sie je ein Beispiel für jede Gruppe. - klausurrelevant!
Name the 4 main types of biologicals. Give an example of each type.
! 1.19. Welche Umgebungsbedingungen führen leicht zur Denaturierung der 3D-Struktur von Proteinen? Nennen Sie 4 davon.
Which environmental conditions easily lead to denaturation of the 3D structure of proteins? Name 4 of them. - klausurrelevant! - wichtig!
1.20. Nennen Sie die 5 Hauptklassen der humanen Immunglobuline. Welche dieser Klassen wird bevorzugt therapeutisch eingesetzt?
Name the 5 main classes of immunoglobulins. Which of these classes is preferred for therapeutic use? Why not the other Ig classes?
klausurrelevant!
Antigenstruktur zeichnen/ skizzieren können in Klausur und beschriften!
1.21 Worin liegt der Unterschied zwischen chimären, partiell humanisierten und vollständig humanisierten Antikörper?
What is the difference between a chimeric, a partially humanised and a fully humanised antibody?
1.22. Was entsteht beim Abbau eines Antikörpers (IgG) mit Pepsin bzw. Papain? Was erhält man bei Reduktion der Disulfidbrücken des Antikörpers (IgG)?
What is produced when an antibody (IgG) is degraded with pepsin or papain? What is obtained when the disulphide bridges of the antibody (IgG) are reduced?
1.23. Wie kann man in der Qualitätskontrolle die Integrität der Primärsequenz eines Antikörpers untersuchen / nachweisen?
How can the integrity of the primary sequence of an antibody be examined / proven in quality control?
1.24. Warum sind Plasmide Polyanionen?
Why are plasmids polyanions?
1.25. Moderne Analysenmethoden für Proteine, vor allem die hochauflösenden Massenspektrometrie sind der Schlüssel zur Zulassung günstiger Nachahmepräparate im Bereich der Biologics“ … Diskutieren sie diese Aussage auf Basis ihrer Kenntnisse aus der Vorlesung
Massenspektrometrie (MS) = wandelt Proteine/ Moleküle in geladene Teilchen (IOnen) um, trennt sie nach ihrem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) & Detektion erfolgt im Massenspektrum.
-> Detektion - Massenspektrum: zeigt im Diagramm welche Ionen/Protein in Probe vorhanden sind & dessen Menge (= je höher Peak, desto mehr davon in Proben)!
Folien & Definitionen wissen!
2.1. Nennen Sie drei kritische Verunreinigungen (allgemein), die im Downstream Processing vom Wirkstoff abgetrennt werden müssen. Gibt es auch unkritische Verunreinigungen? Wenn ja nennen sie bitte auch ein Beispiel dafür.
Name three critical impurities (in general) that must be separated from the active ingredient in downstream processing. Are there also non-critical impurities? If so, please also give an example.
2.2. Berechnen sie, ob die Virusreduktion der folgenden DSP Schritte für den Gesamtprozess ausreicht. (mindestens 1:1 Mrd.).
Angegeben sind doppelte Log Virus Reduction(LRV) Werte der Teilschritte:
Capture AEX: LVR 4,2 / 3.8 // CEX : LRV 2.2 / 2.5
Calculate whether the virus depletion of the following DSP steps is sufficient for the overall process. (at least 1: 1 billion).
The Log Virus Reduction (LRV) = 2 values of the sub-steps for each step.: Capture AEX: LVR 4.2 / 3.8 // CEX : LRV 2.2 / 2.5
2.4. Welchen Vorteil bzw. Nachteil haben Einwegproduktionssysteme in der Biotechnologie?
What are the advantages and disadvantages of single-use production systems in biotechnology?
2.5. Welche Methoden zur präparativen Grobreinigung von Proteinen kennen Sie (Stichworte reichen)?
Which methods for the preparative coarse purification of proteins do you know (keywords are sufficient)?
z. B. Fällung (precipitation), Extraktion (extraction), filtration, ultrafiltration, crystallization, continuous centrifugation
2.6. Nennen Sie Bioseparationstechniken mit hoher und geringer Trennleistung / hohem und geringem Durchsatz (Bezeichnungen / Stichworte reichen).
Name bioseparation techniques with high and low separation performance / high and low throughput (names / keywords are sufficient)
2.7. Was beschreibt das allgemeine RIPP-Schema in DSP-Aufreinigungsprozessen?
What describes the general RIPP scheme in DSP purification processes?
2.8. Wie wirken sich unterschiedliche relative Ausbeuten aufeinanderfolgender Reinigungsprozesse auf die Gesamtausbeute aus? Wie errechnet man die Gesamtausbeute eines Prozesses aus den Teilausbeuten einzelner Prozessschritte?
How do different relative yields of successive cleaning processes affect the overall yield? How can the total yield of a process be calculated from the partial yields of individual process steps?
• Warum ist ein Produktverlust am Anfang von DSP so kritisch?
• Welche Trennverfahren sind in der Teilausbeute besonders kritisch bei schlechter Prozessführung?
Aufg. 2. Welchen Teilprozess sollte man bevorzugt optimieren und warum?
ALLE Teilausbeuten miteinander Multiplizieren!
3.0. Welche Einflussgrößen müssen bei der Ausarbeitung eines Aufarbeitungsprozesses berücksichtigt werden ?
3.1. Welche Separationsmethoden für Proteine kennen Sie ? Welche davon sind präparativ nutzbar?
Which separation methods for proteins do you know? Which of them can be used for large scale biotech production?
3.2. Welche Eigenschaften von Proteinen können für die Separation verwendet werden?
Which properties of proteins can be used for separation?
3.3. Welche Ultrafiltrationsmembran (MWCO 300 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 30 kDa) MWCO würden Sie wählen, um einen Antikörper (160 kDa) aufzukonzentrieren?
Which ultrafiltration membrane (MWCO 300 kDa, 150 kDa, 100 kDa, 30 kDa ) MWCO would you choose to concentrate an antibody (160 kDa) ?
MWCO = Molecular Weight Cut-Off
3.4. Wie sind die Parameter Ausschlussgrenze und Transmembranfluss definiert ? Wozu können Sie verwendet werden?
How are the parameters exclusion limit and transmembrane flux defined? What can they be used for?
3.5. Welche Vorteile bietet die Tangentialflussfiltration (TFF) im Gegensatz zur klassischen Dead End Filtration?
What are the advantages of tangential flow filtration (cross flow filtration) compared to classic dead end filtration?
3.7. Bitte zeichnen sie ein Schaubild einer Tangentialfiltrations(TFF) Anlage mit allen erforderlichen Bauteilen und Ventilen zur Steuerung von Feed Eingangs (P1)-und Ausgangsdrücken (P2) und Permeatdruck(P3). Geben sie die allgemeine Formel für den Transmembrandruck an (allgemein Formel angeben!!)
Please draw a diagram of a tangential filtration (TFF) system with all the components and valves required to control the feed inlet (P1) and outlet
pressures (P2) and permeate pressure (P3). State the general formula for the transmembrane pressure (state the general formula!!)
3.8. Wie verändern sich Retentatdeckschicht und Permeatvolumenstrom bei der TFF-Filtration einer Proteinlösung mit zunehmendem Transmembrandruck (TMP)? Wo liegt der optimale Filtrationsbereich?
How do the retentate cover layer and permeate volume flow rate change with increasing transmembrane pressure (TMP) during TFF filtration of a protein solution ? What is the optimum filtration range ?
3.9. Welche Methoden zur Grobreinigung von Proteinen kennen Sie (Stichworte reichen)?
Which methods for the coarse purification of proteins do you know (keywords are sufficient)?
3.10. Nennen Sie Bioseparationstechniken mit hoher und geringer Trennleistung / hohem und geringem Durchsatz (Stichworte reichen)
Name bioseparation techniques with high and low separation performance / high and low throughput (keywords are sufficient)
3.11. Was beschreibt das RIPP-Schema in der DSP-Bioseparation?
What does the RIPP scheme in DSP bioseparation describe?
3.12. Welche Aufschlussmethoden für Zellen kennen Sie ? Nennen sie kurz wichtige Vor-/ Nachteile der jeweiligen Methode.
Which cell disruption methods do you know? Briefly name important advantages/disadvantages of each method.
3.13. Wie kann der Zellaufschluss von Eukaryoten in der biotechnologischen Produktion von Wirkstoffen durchgeführt werden und was muss dabei auf jeden Fall beachtet werden, um Produktverluste oder unerwünschte Abbauprodukte zu vermeiden?
How can the cell disruption of eukaryotes be carried out in the biotechnological production of active ingredients and what must be taken into account in order to avoid product losses or undesirable degradation products?
3.14. Wie unterscheiden sich Bakterien (gram + / gram -), Hefen, Pflanzenzellen und Tierzellen hinsichtlich ihrer Stabilität beim Zellaufschluss? Geben sie in Stichworten an, wie eine Zellaufschluss erfolgen könnte.
How do bacteria (gram + / gram -), yeasts, plant cells and animal cells differ in terms of their stability during cell disruption? Indicate in keywords how cell disruption could take place.
3.14.1. Welche Aufschlussmethoden kennen Sie ? Vor-/ Nachteile ?
Which cell disruption methods do you know? Advantages/disadvantages?
3.15. Erklären Sie das Prinzip der Kugel- oder Glasperlenmühle für den Zellaufschluss? Nennen Sie Vor-/ Nachteile.
Explain the principle of the ball mill or glass bead mill for cell disruption? Name the advantages / disadvantages
3.16. Wie funktioniert eine French Press für den Zellaufschluss?
How does a French press for cell disruption work?
3.17. Erklären Sie das Funktionsprinzip einer „Kolloidmühle“ ? Durch welche physikochemischen Prozesse werden Gewebe und Zellen homogenisiert?
Can you explain the functional principle of a "colloid mill"? Which physicochemical processes are used to homogenize tissue & cells?
Probe wird zwischen fixen Stator & schnell rotierenden Rotor im engen Spalt beschleunigt (10 000 –50 000 U/min)
-> durch hohe Scherkeräfte, Turbulenzen & Kavitation werden Zellen mechanisch aufgebrochen.
3.18. Welche Methoden sind zum Zellaufschluss in der Produktion geeignet? Beschreiben Sie das Prinzip des Aufschlusses.
Which methods are suitable for cell disruption in production? Describe the principle according to which cell disruption is carried out.
3.19. Wie funktioniert ein kontinuierlicher Separator ?
How does a continuous separator work?
3.20. Wodurch unterscheiden sich die kontinuierliche und die Batch-Zentrifugation ?
What is the difference between continuous and batch centrifugation?
3.21. Wie wirken sich unterschiedliche relative Ausbeuten aufeinanderfolgender Reinigungsprozesse auf die Gesamtausbeute aus? Wie muss bei bekannten Teilausbeuten der Einzelprozesse gerechnet werden?
How do different relative yields of successive purification processes affect the overall yield? How must the calculation be made if the partial yields of the individual processes are known?
3.21.1. Nennen Sie 3 kritische Verunreinigungen (allgemein), die im Downstream Processing vom Wirkstoff abgetrennt werden müssen
Verunreinigungen im Lysat?
3.22. Wie ist der Transmembrandruck bei der TFF (Tangentialflussfiltration) definiert?
How is the transmembrane pressure defined in TFF (tangential flow filtration/ cross flow filtration)?
3.24 Wie unterscheiden sich asymmetrische und symmetrische Membranen in ihrem strukturellen Aufbau? Zu welchem Typ gehören Ultrafiltrationsmembranen?
What is the structural difference between asymmetric and symmetric membranes? To which type do ultrafiltration membranes belong?
3.25. Definieren Sie in Stichworten die Begriffe Filtrat, Permeat, Retentat, Flux, Filterkuchen und Wasserwert.
Define the terms filtrate, permeate, retentate, flux, filter cake and water value in keywords.
Konzentrationspolarization & Fouling
3.25.1 Nennen sie zwei alternative Technologien/ Verfahren die neben Zentrifugation, Filtration und Chromatographie für den Einsatz beim DSP von Proteinen eingesetzt werden.
3.25.2. Was bedeutet das Acronym RIPP im DSP? Nennen Sie für jede RIPP-Stufe ein Aufreinigungsverfahren
3.26. Geben sie ein Aufschlussverfahren für Gewebe, Bakterien, Hefen und Säugerzellen in Suspension an.
Specify a digestion method for tissue, bacteria, yeasts and mammalian cells in suspension
3.27. Begründen sie, warum für continuous feed (Perfusionsfermentation) nur Zellen eingesetzt werden sollten, die das Produkt sezernieren.
Explain why only cells that secrete the product should be used for continuous fed (perfusion fermentation).
3.28. Die elektronenmikroskopischen Bilder zeigen zwei Filtermembranen, die sich in ihrem Aufbau grundsätzlich unterscheiden. Wie bezeichnet man solche Membranen allgemein?
Bitte schreiben sie den Namen des Membrantyps unter die Abbildung.
Ihr Kollege möchte die rechte Membran zur Abtrennung eines niedermolekularen Farbstoffes (Rhodamin B) von einem Antikörper verwenden.
Ihr Chef sagt, er soll die linke Membran benutzen, weil dort die Filtration schneller geht. Wer hat Recht? Begründen sie kurz ihre Wertung.
3.29. Korrigieren sie die Aufbauplanung ihrer Kollegen, damit mit der Anlage eine druckkontrollierte Diafiltration durchgeführt werden kann, mit der eine Antikörperfraktion nach einer Kationentauscher-Aufreinigung in einen Niedrigsalzpuffer überführt werden kann.
Die Bauteile im Plan:
= exakt wie bei TFF Schema mit P1; P2; P3
4.1. Welche 3 chromatographischen Grundprinzipien (keine Techniken wie SEC, .. !!) können für die Präparative Chromatographie eingesetzt werden ?
Which 3 basic chromatographic principles (no techniques like SEC, ... !!) can be used for preparative chromatography ?
4.2. Beschreiben Sie die drei Grundprinzipien der Chromatographie ?
Describe the three basic principles of chromatography ?
4.3. Wie funktioniert die Displacement Chromatographie ? Beschreiben + Skizze.
How does displacement chromatography work ? Describe + sketch
4.4. Was ist der „Displacement Train“ ?
What is the "Displacement Train" ?
4.5. Kann eine bessere Trennsäule (höhere Bodenzahl) eine präparative Trennung mit hoher Säulenüberladung verbessern ?
Can a better separation column (higher plate count) improve a preparative separation with high column overload ?
4.6. Wie verändert sich ein Chromatogramm bei Überladung der Trennsäule ?
How does a chromatogram change when the separation column is overloaded ?
= bei Überladung der Säule Trennung im nicht-linearen Bereich, resultiert Fronting oder Tailing = Verzerrung vom Peak
4.7. Welche Unterschiede gibt es zwischen Analytischer- und Präparativer HPLC ?
What are the differences between analytical and preparative HPLC?
Kriterium
Im Allgemeinen: Analytische vs. präparative Trennung in DSP
4.8. Kann Chromatographie auch als kontinuierlicher Prozess durchgeführt werden?
Can chromatography also be performed as a continuous process?
4.9. Bitte erklären sie mit Hilfe der Grafik, wie die Trennung in der continuous annular chromatography (CAC) funktioniert
a) Wo eluieren die schwach, wo die stark absorbierenden Komponenten?
b) Warum handelt es sich um eine kontinuierliche Chromatographie?
4.10. Berechnen sie die dynamische Bindekapazität der beiden Säulen bezogen auf Säulenvolumen in % und auf Einwaage Säulenmaterial. Sind die Bedingungen für einen Capture Schritt geeignet?
Theorie zur Bindekapazität:
4.11 Beschreiben Sie das Prinzip und drei Elutionsmodi der Elutionschromatographie ?
Describe the principle and three elution modes of elution chromatography ?
4.12. Chromatographiesystem – Folie wissen! Begriffe ergänzen
Skript: Rechenbeispiel DBC
5.1. Erklären Sie das Prinzip der Ionenaustauschchromatographie.
Explain the principle of ion exchange chromatography.
5.2. Welche Elutionmöglichkeiten gibt es in der IEX-Chromatographie?
What are the elution possibilities in IEX chromatography?
5.3. Welche Gruppen tragen zur Gesamtladung von Proteinen bei?
Which groups contribute to the total charge of proteins?
5.4. Welche Schritte definieren den Prozessablauf bei der IEX-Chromatographie? Which steps define the process flow in IEX chromatography?
Equilibrieren = Gleichgewichtseinstellung der Säule mit geeignetem Puffer
= Startpuffer wird durch Säule gespült, um stat. Phase in def. chem. Zustand zu bringen
Ladungsausgleich z.B. Oberfläche stat. Phase wird voll negativ geladen = Aniontauscher
pH-Anpassung, niedrige Salzkonzentration z.B. bei AEX wird Säule mit niedrigen Puffer bei pH 8 gespült
5.5. Welche chemische Grundstruktur haben die funktionellen Gruppen bei gebräuchlichen Ionenaustauschern? Je ein Beispiel stark / schwach CEX / AEX?
What is the basic chemical structure of the functional groups in common ion exchange resins? One example each strong / weak CEX / AEX?
5.6. Wie werden schwache und starke Ionenaustauscher definiert?
How are weak and strong ion exchangers defined?
5.7. Warum ist die statische Beladungskapazität eines Ionentauschers größer als seine dynamische Beladungskapazität und kleiner als die max. Beladungskapazität?
Why is the static loading capacity of an IE larger than its dynamic loading capacity and smaller than the max. loading capacity?
5.8. Welche Parameter beeinflussen die dynamische Beladungskapazität eines Ionentauschers?
Which parameters influence the dynamic loading capacity of an ion exchanger?
5.9. Was ist bei der Wahl von Puffern für die IEX-Chromatographie zu beachten?
What should be considered when choosing buffers for IEX chromatography?
5.10. Welche Parameter müssen beim Upscaling einer Methode in der präparativen IEC optimiert werden?
Which parameters have to be optimized when upscaling a method in preparative IEC?
5.11. Wie wirken sich die Änderung der Beladung, der Flussrate und der Gradientensteilheit auf eine IEC-Trennung aus?
What is the effect of changing the loading, flow rate and gradient slope on an IEC separation?
5.12. Was bedeuten folgende Abkürzungen : SAX, WAX, SCX, WCX?
What do the following abbreviations mean : SAX, WAX, SCX, WCX?
5.13. Welches Ion ist der stärkere Eluent-Li+ oder K+, K+ oder Ba2+?
Which ion is the stronger eluent - Li+ or K+ , K+ or Ba2+ ?
5.14. Wann müssen IEC-Säulen regeneriert werden ? Welche Reagenzien möglich?
When do IEC columns need to be regenerated ? Which reagents are possible?
5.15. Was sind Vorteile , was Nachteile der IEC?
What are advantages , what are disadvantages of IEC?
IEC - Vorteile:
1) Einfaches Prinzip
2) vorhersagbare, planbare Trennungen, robust
3) es gibt dazu viele Erfahrungen
4) schonend für Proteine = biologische Aktivität bleibt erhalten
5) günstiges Preis-Leistungs-Verhältnis
6) gute Regenerierbarkeit
7) hohe Kapazität
IEC - Nachteile:
1) Salzkonzentration in Probe darf nicht zu hoch sein ca.10- 50mM
2) bei Proteinen mit sehr ähnlicher Ladung z.T. schlechte Trennung
5.16. Erklären Sie das Prinzip der SEC? Wodurch unterscheidet Sie sich von allen anderen chromatographischen Methoden?
Explain the principle of SEC ? How does it differ from all other chromatographic methods?
5.17. Welche Voraussetzungen müssen Probe, stationäre Phase und mobile Phase bei SEC erfüllen?
Which requirements must the sample, stationary phase and mobile phase fulfill in SEC?
Antwort:
• Probe: darf die stationäre Phase nicht beschädigen (z. B. keine Agglomerate, keine Reaktionen)
• Stationäre Phase: muss stabil und inert sein
• Mobile Phase: isotonisch & kompatibel mit der Probe (z. B. 150 mM NaCl zur Vermeidung von Wechselwirkungen)
5.18. Warum ist die Trennung in der Separation bei niedriger Flussrate besser als bei hoher Flussrate?
Why is the separation in the separation at low flow rate better than at high flow rate?
5.19. Welcher Parameter der stationären Phase definiert bei der SEC den Trennbereich?
Which parameter of the stationary phase defines the separation range in SEC?
Antwort: Pore size (= Porengröße) der stationären Phase:
-> Gibt an, welche Molekülgrößen voneinander getrennt werden können
-> Trennbereich liegt zwischen Ausschlussvolumen und vollständiger Permeation
5.20. Welche Möglichkeiten gibt es, die Trennleistung der SEC zu verbessern?
What are the possibilities to improve the separation performance of the SEC?
5.21. Welches sind Vor-bzw. Nachteile der SEC?
What are the advantages and disadvantages of SEC?
5.22. Beschreiben Sie das Trennprinzip der Hydrophoben Interaktionschromatographie?
Describe the separation principle of hydrophobic interaction chromatography?
5.23. Welcher Parameter beeinflusst die Trennleistung der HIC am stärksten?
Which parameter influences the separation performance of the HIC the most?
5.24. Nach welchem Kriterium sind die Ionen in der sogenannten Hofmeister Serie geordnet?
According to which criterion are the ions in the so-called Hofmeister Series ordered?
5.25. Was bedeuten „Aussalzeffekt“ und „chaotroper Effekt“ in Zusammenhang mit der HIC?
What do "salting-out effect" and "chaotropic effect" mean in connection with HIC?
5.26. Was sind wichtige Parameter für die Optimierung der HIC-Separation?
What are important parameters for the optimization of HIC separation?
5.27. Erklären Sie das Prinzip der Affinitätschromatographie (AC).
Explain the principle of affinity chromatography (AC).
5.28. Welche Elutionsmodi gibt es in der AC und was sind deren Vor- und Nachteile?
What are the elution modes in AC and what are their advantages and disadvantages?
5.28. Welche Elutionsmodigibt es in der AC und was sind deren Vor- und Nachteile?
5.29. Was ist der Unterschied zwischen gruppenspezifischen und monospezifischen Liganden in der AC?
What is the difference between group-specific and monospecific ligands in AC?
5.30. Welche Schritte definieren das Ablaufschema einer AC?
Which steps define the flowchart of an AC?
5.31. Welche Proteine können mit Protein A / G Affinitätschromatographie aufgereinigt werden?
Ist diese AC monospezifisch? Which proteins can be purified by protein A / G affinity chromatography? Is this AC monospecific?
5.32. Was bedeutet IMAC?
What does IMAC mean?
5.33. Welche Liganden werden bei IMAC benutzt?
Which ligands are used in IMAC?
5.34. Welche Elutionsbedingungen gibt es für IMAC?
What are the elution conditions for IMAC?
5.35. Beschreiben Sie in Stichworten den Ablauf einer IMAC-Trennung?
Describe in keywords the process of an IMAC separation?
5.36. Die folgende Abbildung zeigt die Gesamtladung der drei Proteine A und B in Abhängigkeit vom pH-Wert der Lösung. Aus dieser Abbildung lassen sich verschiedene Größen ablesen, mit denen sie ihre IEX-Trennung planen können.
Bitte geben sie die isoelektrischen Punkte der beiden Proteine an (schätzen).
The following figure shows the total charge of the three proteins A and B as a function of the pH of the solution.
From this figure, various quantities can be read that they can use to plan their IEX separation.
Please indicate the isoelectric points of the two proteins (estimate)
5.37. Bitte ordnen sie die folgenden funktionellen Gruppen den verschiedenen Ionentauscherklassen (WAX, WCX, SCX, SAX) zu. Welche Gruppen sind nicht als Ionenaustauscher geeignet (NEIN-Eintragen ).
Please assign the following functional groups to the different ion exchange classes (WAX, WCX, SCX, SAX). Which groups are not suitable as ion exchangers (NO Enter)
Folie wissen:
5. Folie wissen:
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