Experimente

Zellenüberlebenskurve (Cell Survival)

Grundprinzip: Zellen bestrahlen, anschließend prüfen welche Zellen überhaupt noch Kolonien bilden können

(Gewissen Ziellinien sind Strahlensensitiver o. resistenter)

Anwendung für Strahlenbiologie: häufig benutzte Methode

• Zelllinien mit bestimmten Mutationen in Genen für Proteine in einem der zwei Hauptreparaturwege (grün=HR, blau= NHEJ, AA8 und K1 WT aus Zelllinie CHO als Vergleich)

• Bestrahlung mit verschiedenen Dosen (Einheit Gray [Gy=J/kg]) an Röntgenstrahlung (X-Rays) und messen des zellulären Überlebens (überleben = Koloniebildung) von Zellen in G1 (warten, bis Zellen zur Konfluenz wachsen und aufhören zu wachsen und keine Replikation)

• WT-Zelllinien= Überleben reduziert auf 10 % nach Bestrahlung mit höchster Dosis (10 Gy)

• NHEJ-Mutanten= strahlensensitiv, nicht die höchste Dosis benötigt, um das Überleben auf 10 % zu senken 1 Gy ausreichend, zeigt Wichtigkeit dieses Reparaturweges

• HR-Mutante= strahlensensitiver, aber nicht so stark wie NHEJ-Mutante

Experiment 1: Zellzyklusanalyse des Auftretens und Reparatur von spontanen DSBs

-> Haupterkenntnis: Spontane DSBs entstehen in S-Phase und werden erst nach Übergang in G2-Phase repariert

• Vorgehen

  • Zellzyklusanalyse

  • Anfärben der verschiedenen Zyklusphasen mit Nukleotidanalogons > EDU -> wird in S-Phase eingebaut > BrdU -> wird auch in S-Phase eingebaut

    • Erstmal färben sich alle Zellen in allen Phasen blau (Dapi)

    • Zugabe EdU (rot) -> Zellen in S-Phase färben sich rot, anderen Zellen bleiben blau

    • Abwaschen + Inkubation

    • Zugabe BrdU (grün) -> Zellen, die immer noch in S-Phase sind färben sich gelb um (rot + grün) -> Zellen, die vorher in der G1 waren und zum Zeitpunkt der Färbung in S-Phase übergegangen sind färben sich grün -> Zellen, die aus der S-Phase zum Zeitpunkt der Färbung in die G2 übergegangen sind, bleiben rot

  • Außerdem PCNA Synthese (Marker für DNA-Polymerase)

-> Ergebnisse

• spontane DSBs entstehen v.a. während der S-Phase

• PCNA bestätigt Zellen befinden sich in der S-Phase (nur in S-Phase Replikation = DNA-Pol nur in S-Phase aktiv)

• DSB Reparatur, nachdem Zellen in G2 übergegangen sind

Experiment 2: Einfluss auf Polq auf die Reparatur resektierte DSB -> Haupterkenntnis: Stark erhöhte DSB-Werte im darauffolgenden G1, wenn sowohl HR als auch POLθ ausgeschaltet sind & In HR-defizienten Zellen (BRCA2, RAD51) werden spontane DSBs in der Mitose durch TMEJ repariert!

-> Vorgehen:

• Gezieltes Knockout von:

  • Polq

  • BRACA2

  • RAD51

• Zellzyklusfärbung (BrdU & EdU) zur Zellzyklusphasen Bestimmung

-> Ergebnisse:

• Polq knockout hat keinen messbaren Effekt auf DSB-Level (in G2)

• Nach 7h > gleiches Maß an DSB in allen Proben

• Nach 12h in G2 Phase > in Kontrollen wurden DSB repariert > Polq inhibiert -> DSB über HR repariert

• BRA2 Knockout & BRA2 & Polq & RAD51-> DSB nicht repariert

• Nach 12h in G2 > wurde Polq zusätzlich inhibiert wurden DSBs nicht mehr repariert (HR weg & TMEJ deaktiviert) > wurde nur BRCA oder RAD51 inhibiert konnten DSB repariert werden (HR & TEMJ aktiv) HR Defiziente Zellen (BRCA2, RAD51) reparieren spontane DSBs = muss in Mitose passiert sein = hier findet TMEJ statt = Schlüsselprotein dafür ist Polq

Die Rolle von POLθ wurde durch mehrere unabhängige Experimente bestätigt:

• Mithilfe von Zellzyklusanalyse (EdU/BrdU-Markierung + FACS) zeigte man, dass TMEJ in der Mitose stattfindet.

• POLθ-Depletion führte in Fibroblasten und anderen Zelllinien zu erhöhten DSB-Signalen in G1.

• Camptothecin (Topoisomerase-Inhibitor) erzeugt persistent bleibende DSBs – deren Reparatur war POLθ-abhängig.

• Auch nach Bestrahlung (2 Gy) oder anderen DSB-induzierenden Mitteln war die Reparatur bei POLθ-Defizienz gestört.

1. PARP erkennt DSB-Enden und leitet den TMEJ-Reparaturweg ein.

2. Eine PARP-Inhibition (PARPi) erzeugt DSBs in der S-Phase, da die Replikation gestört wird.

3. Diese DSBs werden später in der Mitose durch TMEJ repariert – auch ohne PARP.

4. Mitotische TMEJ-Reparatur ist unabhängig von PARP.

5. Ein Verlust von POLθ verhindert jedoch die Reparatur dieser DSBs → DSBs bleiben bestehen.

6. Kombinierte Inhibition von PARP und POLθ führt zu synthetischer Letalität, v. a. in HR-defizienten Zellen. → Therapeutisch interessant für Kombinationstherapien gegen BRCA-mutierte Tumoren.

1. In BRCA2- und RAD51-defizienten Zellen (HR-defizient) erfolgt die Reparatur endogener & exogener DSBs durch TMEJ (POLθ-vermittelt), besonders in der Mitose.

2. Verlust von POLθ führt zu genotoxischen Effekten (z. B. Mikronuklei, „lagging chromosomes“). → Dies erklärt die synthetische Letalität von BRCA2- und POLθ-Verlust.

3. PARP-Inhibitoren verursachen DSBs in der S-Phase, beeinflussen aber mitotisches TMEJ nicht. → Kombinierte Inhibition von PARP und POLθ wirkt synergetisch toxisch auf HR-defiziente Zellen. → Relevanz für Krebstherapie bei BRCA2-mutierten Tumoren!

1. In WT-Zellen: RAD52-Foci sind selten und kolokalisieren kaum mit RAD51.

2. In BRCA2-defizienten Zellen:

   • RAD52 wird an DSBs rekrutiert, blockiert TMEJ und entfernt sich erst in Mitose.

   • RAD52-Deletion behebt den Reparaturdefekt – aber nur, wenn POLθ vorhanden ist.

   • Die „Rettung“ geht mit Chromatidfusionen einher.

3. RAD52 verhindert POLθ-abhängige Anaphase-Brücken, indem es TMEJ bis zur Mitose hemmt. → Fazit: RAD52 wirkt als Regulator von TMEJ und schützt vor frühzeitiger, fehlerhafter Reparatur.

1. RAD52 schränkt TMEJ bis zur Mitose ein, um fehlerhafte Reparatur zu verhindern.

2. RAD52-Deletion in BRCA2-defizienten Zellen aktiviert TMEJ schon in G2.

3. Dies führt zu genotoxischen Effekten:

   • Chromosomale Fusionen

   • Anaphase-Brücken

4. Synergetische Letalität von BRCA2- und RAD52-Verlust: → Durch Enthemmung von fehleranfälligem TMEJ in G2

1. Unerwartet: DSB-Resektion tritt auch in der G1-Phase auf – obwohl keine Schwesterchromatide für HR vorhanden ist.

2. Resektion war unabhängig von RAD51 (HR-Mediator), also nicht HR-vermittelt.

3. Nachweis durch:

   • pRPA-Foci (bindet an ssDNA → Marker für Resektion)

   • RAD51-Foci zur Kontrolle (HR-Aktivität)

4. PLK-Inhibition blockiert Resektion → pRPA-Foci nehmen ab, DSBs bleiben unrepariert.

5. siCtIP / siBRCA1 / siExo1 Knockdowns zeigen gleichen Rückgang der pRPA-Foci → koordinierter Mechanismus. → Fazit: Es gibt einen alternativen, nicht-HR-basierten Resectionsweg in G1, z. B. für NHEJ oder TMEJ.

-> aus zusammenfassung:

Experiment 1: Resektion tritt in G1 auf

-> Haupterkenntnis:     

• durch RAD51 Inhibierung in Resektion nicht beeinflusst     

• Resektion, die typischerweise mit HR assoziiert ist und in der S/G2-Phase stattfindet,         tritt überraschenderweise auch in der G1-Phase auf, wo die Zelle           keine Schwesterchromatide für HR hat

-> Vorgehen:

• Verwendete Zellen: Maus Stammzellen (befinden sich in G1, in Stammzellen ist genomische Integrität stabil und verwenden daher bestmöglichen Reparaturweg)

• Zellen werden bestrahlt in G1)

  & nur in G1 analysiert

• RPA: Marker für resektierte DNA (phosphorylierte Form, da phosphoryliert nachdem an ssDNA bindet)

• RAD51: durch BRCA2 an ssDNA

• Analyse der pRPA & RAD51 Foci zeigt bei Analyse nach 2 h Bestrahlung Resektion, da pRPA Foci

• Dann PLK-Inhibitor dazugegeben (inhibiert Resektion) und zeigt DSBs nun unrepariert bleiben, da Foci Anzahl nicht zurückgeht

• Kein Artefakt, da Inhibierung von PLK zeigt, dass die Anzahl an pRPA foci zurück geht, siCtIP (initiiert Resektion)/siBRCA1/siExo1 zeigen gleichen Rückgang=koordiniert

Experiment 2: Fill in Synthese tritt in resektierten DSB in G1 auf

-> Haupterkenntnis: Resektierte DSBs in der G1-Phase werden d. Auffüllsynthese unter Beteiligung von DNA-Polymerase α (POLα) repariert. Ohne funktionelle POLα bleiben diese Brüche unrepariert

• Fill in Synthese wird in Telomeren gefunden (DNA Enden)

• Exkurs Telomere:

  • Nach jeder Replikation werden Telomere ein Stück kürzer

  • Replikation läuft immer von 5‘ zu 3‘

  • Dadurch einen leading & einen leaking Strang

  • Deshalb wir ein Stück nicht mit synthetisiert (ca. 6 Basenpaare)

  • Ein immer kürzer werdendes Telomer ähnelt einem DSB (Spermazellen umgehen dieses Problem durch ihre Telomerase, Tumore reexprimieren Telomerase)

  • Telomerasen: (Polymerase alpha) fügen ssDNA an Telomerende, machen aus ssDNA dsDNA und darüber fill-in Synthese

• Fill in der DNA: für NHEJ wird der DSB bei resektierten Enden aufgefülltS

• Geschieht durch Pola – Füllt Lücken auf (normalerweise innitiert Pola die DNA replikation & ist an der Synthese kurzer RNA primer beteiligt.

-> Haupterkenntnis:    

• Mit dem ER-I-PpoI-System können ortsspezifische DSBs kontrolliert induziert werden,

• was die detaillierte Untersuchung der Resektion an diesen Stellen ermöglicht.

• Die Induktion von DSB von 4-OHT zeigte im weiteren Zeitverlauf (nach Entfernung von 4-OHT) eine kontinuierliche Reduzierung der Foci, demnach kann daraus geschlossen werden, dass diese repariert werden und davon einige resektiert werden und andere nicht (pRPA Foci)      - Das System bestätigt, dass Resektion (erkennbar an pRPA-Foci) nach der DSB-Induktion auftritt.

-> Methode:

• Unterschied zur Bestrahlung: wir kennen die Sequenz die angegriffen wird

• Bestrahlung: randomisiert verteilte DSBs

• ER-I-PpoI-System: gentechnisches System, um DSBs spezfischen, festgelegten Stellen im Genom zu erzeugen

  • I-PpoI: Restriktionsendonuklease (ein "DNA-Schere"), die an einer spezifischen Sequenz schneidet und so einen DSB erzeugt.

  • ER (Östrogenrezeptor-Domäne): An I-PpoI angehängt, hält diese Domäne I-PpoI inaktiv im Zytoplasma der Zelle gefangen.

  • HA

  • 4-OHT (4-Hydroxytamoxifen): bindet an die ER-Domäne bindet. Durch diese Bindung löst sich I-PpoI von der ER-Domäne und kann in den Zellkern gelangen, um dort die DNA zu schneiden und DSBs zu erzeugen.

  • DD (Destabilization Domain): Ermöglicht den schnellen Abbau des I-PpoI-Proteins, wenn ein stabilisierendes Molekül (z.B. Shield-1) entfernt wird. Dies bietet eine sehr feine Kontrolle über den Zeitpunkt und die Dauer der I-PpoI-Aktivität

-> Vorgehen:

• Zugabe Tamoxifen (4-OHT = Hormon): Aktivierung

  > Komplex braucht Tamoxifen zur Aktivierung

  > Restriktionsenzym in den Nukleus

• Zugabe Shield-1: Inaktivierung

  > bindet an degradationsdomaine des komplexes

-> Haupterkenntnis: Doppelstrangbrüche, die innerhalb von transkriptionell aktiven Regionen (also innerhalb von Genen, den "intragenen Regionen") liegen, werden in der G1-Phase bevorzugt einer Resektion unterzogen. Dieser Prozess ist CtIP-abhängig

·         Vorgehen

o   CHIP-qPCR Sytem (Chromatin-Immunpräzipitation quantitative PCR) für pRPA und γH2AX. > Technik, um zu sehen, welche Proteine (hier pRPA oder γH2AX) an bestimmten DNA-Abschnitten gebunden sind. Ein höheres Signal bedeutet mehr Bindung

>        CHIP-Technologie: Extrahierung des Chromatins von vielen Zellen und Antikörper nur für γH2AX und dieses präzipitieren

>        Immunopräzipitation des Chromatins: z.B. mit magnetischen Beads, ziehen nur die „runter“ γH2AX, alle anderen werden weggewaschen

>        Primer für PCR: Erkennungssequenz vom Resektionsenzym

o   CtIP: Ein Protein, spielt Schlüsselrolle bei der Initiierung der DNA-Resektion spielt. -> Hemmung von CtIP verhindert die Bildung von pRPA-Foci an intragenen Brüchen

o   Ziel:

§  Vergleich versch. chromosomaler Regionen (intragen, intergen, ungeschnitten), nachdem mit 4-OHT DSBs induziert wurden,

§  & wie sich dies unter Einfluss von Inhibitoren (PLKi, siCtIP) ändert

Experiment 5: Analyse der DSB-Reparaturtreue in G1 mittels qPCR

-> Haupterkenntnis: Die effiziente Reparatur von intragenen DSBs in G1 erfordert sowohl Resektion (CtIP-abhängig) als auch die Aktivität von POLα. Bleiben diese Prozesse aus, bleiben die DSBs (γH2AX-Foci) bestehen.

• weitere ChIP-qPCR-Analyse, zeigt Reparatur von γH2AX an intragenen/intergenen Regionen nach 4-OHT-Behandlung und mit Inhibitoren (PLKi, siCtIP)

• Resektion und die anschließende Auffüllsynthese durch POLα findet nicht nur statt, sondern auch notwendig für erfolgreiche Reparatur dieser spezif. Art von Brüchen

Techniken um spezifisch Nuclei zu untersuchen, wie weit Resektion lief (wie viel resektiert wurde)

-> END-seq Technik: Erkennung DNA-Enden und Sequenzierung

• Funktionsweise: benutzt Adapter (?) um an Bruch zu binden, zweiter Adapter bindet nach dem die DNA extrahiert wurde an der anderen Seite

• Next generation sequencing

• Zugabe von Adaptern die 1. An DSB-Bruchstelle 2. An der anderen Seite binden

• Dann primer gegen Adapter kreieren

• Dann Sequenzierung

• Diese Technik kann modifiziert werden – um resektion zu messen 1. Alle einzelstrang DNA wird entfernt 2. Dadurch verändert sich transkriptionsstart anhand dessen kann gemessen werden wie weit resektion war (o. auch Fill in)

• Keine Resektion:

• Resektion:

Experiment 6: DSBs in intragenetischen Regionen -> Haupterkenntnis: in intragenetischen Bereichen findet NHEJ statt, mittels Endresektion und Fill-in Synthese?

-> Im Vergleich dazu findet in intergenetischen Bereich (Transkription inaktiv) keine Resektion über NHEJ Weg statt

Sequenzierung END-Seq Analyse (genome chart mit bidirektionaler Transkription)

·         - 4OHT= keine DSB, und so auch keine Resekion

·         + 4OHT= (Ctrl) zeigt Resektion

·         +4OHT und PLKi= Inhibierung der Resektion zeigt verringerte/keine Resektion+4OHT und Polymerase alpha i= Inhibierung der Fill-in Synthese zeigt dass es zu erhöhter Resektion kommt

·         Polymerase 2 Ser5P= RNA Polymerase, zeigt dass Resektion genau dort stattfindet wo sich die RNA Polymerase aufhält

Angenommener Weg für die Reparatur in intragenetischen Bereichen über NHEJ:

Foci Analyse zur DSB Detektion -> DSB werden mikroskopisch als fluoreszierende Punkte, sogenannte „Foci“ sichtbar gemacht

·         Sichtbarmachung DSBs durch Marker Proteine die sich an DSB anlagern:

o   yH2AX -> direkt nach DSB-Entstehung wird das Histon H2AX d. Kinasen phosphoryliert (wie z.B. ATM ) -> phosphorylierte Form des Histons nennt sich yH2AX = yH2AX markiert frühen DSB -> dabei 1 zu 1 Verhältnis (1 Foci = 1 DSB)

o   53BP1: Kolokalisierung mit yH2AX -> nach yH2Ax akkumuliert 53BP1 an selben DSBs = Marker zu späterem, aber immer noch frühem Zeitpunkt

·         Verlust der Foci = Reparaturindikator

o   Lineare Korrelation von Strahlungsdosis und DSBs bei sehr geringen Dosen (mGy Bereich=natürliche Strahlenexposition)

o   Zuerst von rothkamm & Löbrich im Jahr 2003 gezeigt

Experiment 1: linearer Zusammenhang von DSB und Strahlungsdosis -> Hauptaussage: Linearer Zusammenhang von DSB und Strahlungsdosis

·         Höhere Strahlungsdosis: erzeugt tendenziell mehr DSB, geringere Strahlungsdosis: erzeugt weniger DSB

·         ABER: DSB werden bei geringeren Dosen weniger effizient repariert.

-> verifiziert in mehrrren Zellinien & mit Neocarcinostatin (Medikament welches DSBs induziert) anstelle von Strahlen

Experiment 2: DSB Reparatur wird durch H2O2 Zugabe stimuliert -> Hauptaussage: DSB Reparatur kann durch H2O2 Zugabe stimuliert werden & ist DNA-PK abhängig      = DSB Reparatur zeigt eine induzierbare Antwort (gewisses Maß an allgemeinen Zellschäden oder Stress nötig um effiziente DSB Reparatur zu aktivieren.

·         Zugabe weniger Radikale verstärkt DSB Reparatur

·         Bei Zugabe DNA-PK Inhibitor sinkt reparaturrate enorm ab -> DNA-PK wichtig für NEHJ

·         Überprüfung erfolgte durch mehrere Zelllinien & Neocarcinostatin anstelle von Röntgenstrahlen

=> NHEJ kann durch Radikale bei sehr niedrigen Strahlungsdosen stimuliert werden

Experiment 3: DNA-PK Aktivität in Zellen -> Hauptaussage: DNA-PK ist nach sehr niedrigen Dosen nicht aktiv, kann aber durch ROS aktiviert werden, daher ergibt sich die Korrelation der DNA-PK Aktivität mit der Reparatureffizienz

·         ATM und DNA-PK können beide H2AX bei hohen Dosen phosphorylieren

·         Bei Hemmung beider, findet keine Phosphorylierung statt

Experiment 4: PDX1 inhibiert DNA-PK Aktivität & Reparatur -> Hauptaussage: Korrelation von DNA-PK-Aktivität und Reparatureffizienz

·         Schlüsselprotein: PRDX1 -> bindet an Proteine & schützt diese vor Radikalen (Peroxiredoxine)

·         Ergebnisse

o   Entfernen PRDX5: DNAPK ist aktiv & repariert DSB

o   Entfernen PRDX1: DNA-PK wird nicht aktiviert & keine Reparatur DSB

Experiment 5: Katalytische Cysteine von PRDX1 beeinflussen die DNA-PK Interaktion -> Hauptaussage:

·         Forschungsfrage: Wie genau binden die PRDX1 (=Dimere)/Wie genau beeinflusst die Bindung von PRDX1 die Activität von DNA_PK

o    PRDX1 bindet an DNA-PK

o   sie formen kovalente Disulfidbrücken zw. 2 Cysteinen (Cys52 auf DNA-PK)

o   werden Radikale hinzugegeben kommt es zur Oxidierung der Disulfidbrücken

o   das löst PDX1 von DNA-PK

·          

·         Überprüfung durch Mutanten:

o    Mutanten d. keine Disulfidbrücken ausbildet, bleibt DNA-PK inaktiv

o   Mutanten, er immer Disulfidbrücken bilet, bleit DNA-PK aktiv – keine DSB Reparatur

Experiment 6: Studie an menschlichen Probanden (Kindheitskrebspatienten) -> Hauptaussage: Während gesunde Personen eine ineffiziente Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen nach niedrigen Strahlungsdosen zeigen, weisen Kindheitskrebspatienten eine effiziente Reparatur auf

·         Vorgehen

o   Es wurden Fibroblasten von über 200 Personen untersucht:

o   68 mit einer zweiten Primärtumorerkrankung (SPN),

o   68 mit einer ersten Primärtumorerkrankung (FPN) und

o   68 krebsfreie Freiwillige (0PN).

o   Die Probanden waren 19-52 Jahre alt und hatten in der Kindheit eine Krebsdiagnose und/oder -behandlung erhalten oder waren krebsfrei.

o   Die Foci-Quantifizierung erfolgte mittels des computergestützten "AutoFoci"-Systems, das Auswertung von ca. 5000 Zellen pro Probe ermöglicht

·         Ergebnisse:

o   Wie viele DSBs wurden nach den versch. Bestrahlungen nicht repariert? -> Bei geringerer Dosis bleiben DSB unrepariert = Dose Effekt

o   DSB-Reparatur nach extrem niedrigen Dosen ist bei krebsfreien Freiwilligen ineffizient (N=68)

o   DSB-Reparatur nach extrem niedrigen Dosen ist bei Krebspatienten im Kindesalter effizient (N=138)

o   Kein Einfluss von Alter, Geschlecht oder Krebsart

Experiment 7: Zelltod nach der Bestrahlung mit sehr niedrigen Dosen, wenn Zellen proliferieren

-> Hauptaussage: Zellen, die noch unreparierte Brüche hatten und in dem Experiment „gezwungen wurden“ zu wachsen starben, da sie sonst nach Reparatur Mutationen tragen würden. Also „in Kauf nehmen“, dass Zellen fehlen, da diese ersetzt werden durch gesunde replizierenden Zellen

·         Dadurch wird die Entstehung von Krebs umgangen