Protein Engineering

Transkription (DNA → mRNA)

• Ort: Zellkern (bei Eukaryoten)

• Ablauf:

  • Die DNA wird aufgespult, und das benötigte Gen wird abgelesen.

  • Die RNA-Polymerase bindet an den Promotor des Gens.

  • Sie liest den DNA-Strang in 3'-5'-Richtung ab und erstellt eine prä-mRNA in 5'-3'-Richtung.

• Ergebnis: Einsträngige prä-mRNA, die die komplementäre Kopie des codierenden DNA-Strangs ist.

Translation (mRNA → Protein)

• Ort: Im Zytoplasma an den Ribosomen

• Ablauf:

  • Die mRNA bindet an ein Ribosom.

  • tRNAs bringen passende Aminosäuren (je nach Codon – 3-Basen-Sequenz).

  • Die Basensequenz der mRNA wird in eine Aminosäuresequenz übersetzt.

  • Die Aminosäuren werden zu einer Polypeptidkette verbunden.

• Startcodon: AUG (Methionin)

• Stoppcodon: z. B. UGA, UAA, UAG

• Ergebnis: Ein lineares Protein (Polypeptid)

Teilgebiet der Biochemie und Biotechnologie.

Untersuchung: Konstruktion, Optimierung & Herstellung Proteine, Enzymen

Hier Schwerpunkt: Optimierung.

Idee: „Optimierung von Enzymen um deren Reaktionsmechanismus zu verstehen und

für die bessere industrielle Anwendbarkeit“.

Veränderung eines Proteins durch gezielte oder zufällige Mutagenese

des codierenden Gens (und somit auch des entsprechenden Proteins).

Rolle der Aminosäuren für:

• katalytische Aktivität

• Bindungseigenschaften

• dreidimensionale Proteinstruktur zu untersuchen

Neue Proteine mit

• optimierten Eigenschaften

• spezifische Funktionen zu erzeugen

Primärstruktur: Aminosäuren verbunden über Peptidbindungen

Sekundärstruktur: Faltung der Aminosäureketten über Wasserstoffbrückenbindungen

→ 𝛼-Helix oder β-Faltblattstruktur

Tertiärstruktur: Faltung der Peptidkette über Disulfid-, Wasserstoff-, ionische und

hydrophobe Wechselwirkungen

Quartärstruktur: Bildung von Untereinheiten über Kombination der Proteinketten

Substrat Hemmung: Manchmal hemmt das Substrat selbst bei hoher Konzentration das Enzym (z. B. durch Blockierung der aktiven Stelle).

Ziel: - Enzymaktivität verbessern -> um Substrathemmung zu verringern

- Substratzufuhr optimieren -> Prozessbedingungen anpassen

=> Modifizierung des Enzym, sodass es bei hoher Substratkonzentration weiter gut arbeitet.

Produkt Hemmung: Das Produkt der Reaktion hemmt das Enzym (häufig bei reversiblen Reaktionen).

Ziele:

• Enzymaktivität gegenüber dem Produkt verbessern → Mutation, die Produktbindung schwächt

• In-situ-Produktentfernung → Produkt wird direkt aus dem System entfernt (z. B. durch Adsorption)

=> Man verändert das Enzym, sodass es weniger durch das Produkt gehemmt wird.

Indirektes Protein Engineering: Toleranz des Enzyms gegenüber schwierigen Bedingungen oder Substraten zu verbessern – z. B. bei Gleichgewichtsreaktionen.

Ziel:

• Gleichgewicht verschieben zugunsten des Produkts, indem das Enzym mehr Substrat oder Produkt aushält, ohne inaktiv zu werden.

=> Man verändert das Enzym so, dass es z. B. hohe Konzentrationen eines Reaktanten aushält.

• Verbesserte katalytische Aktivität

• Breitere und/oder veränderte Substratspezifität

• Bessere Temperaturstabilität

• Stabilität in Gegenwart organischer Lösungsmittel

• Stabilität bei erhöhten Salzkonzentrationen

• Neue Produkte

• Protein/Enzym muss sich vorteilhafter gewinnen lassen

• Produktion muss ökonomisch, hoch effizient und basierend auf günstigen

  Rohstoffen durchgeführt werden (wirtschaftlicher)

• Geeignetes Expressionssystem muss gefunden werden

  (große Auswahl mit Vor- und Nachteilen)

Zufällige Mutagenese:

• z. B. durch UV-Bestrahlung oder error-prone PCR

• High-Throughput Screening

• Detaillierte Untersuchung und Auswahl der besten

  Kandidaten

=> Gerichtete Evolution

Gezielte Mutagenese:

• Durch gezielten Austausch einzelner Basenpaare des

  Gens (PCR-Methoden)

• Hierfür tiefes Verständnis für Reaktionsmechanismus

  erforderlich (durch Experimente oder Modellierung)

=> (Semi-)Rationales Proteindesign

1. Erstellung einer Mutantenbibliothek (Viele Varianten des Ausgangsproteins erzeugen mit z.B. Zufällige Mutagenese, DNA-Shuffling)

2. Wahl eines geeigneten Expressionssystems (Die mutierten Gene werden in Wirtszellen (z. B. E. coli) eingebracht)

3. Leistungsfähiges Screening (Varianten identifizieren, erzeugt große Bibliotheken mit großer Anzahl an Proteinvarianten)

4. Isolierung der „besten“ Varianten

5. Wiederholung

Screening = Jede Variante wird getestet (z. B. auf Aktivität, Stabilität etc.)

Selektion = Nur Varianten, die unter bestimmten Bedingungen überleben oder funktionieren, bleiben übrig

1. Wirtszelle (z. B. Bakterium, Hefe, Säugerzelle, führt Proteinproduktion durch)

2. Expressionsvektor (z. B. Plasmid mit dem Zielgen und Kontrollsequenzen)

Ziel: Effiziente Produktion eines funktionellen Proteins, z. B. für medizinische, industrielle oder Forschungszwecke.

1. Bakterien (z.B. E. coli)

2. Pilze (z.B. Hefen)

3. Säugetier Zellen (z.B. Mensch, Maus, Fisch, Insekten)

4. Pflanzenzellen (z.B. Mais, Tabak)

1. Mikrobielle Expressionssysteme (einfacher zu handhaben und zu validieren)

2. Eukaryontische Expressionssysteme (Kompliziert zu handhaben (Kultivierung und Expression von Proteinen), aber posttranslationale Modifikationen sind möglich.)

Rationales Design nutzt die Bioinformatik:

• Gezielte Strategie zum Entwurf von Enzymen

• Häufig unterstützt durch molekulare Modellierung

Bevor man ein Protein herstellen kann, muss entschieden werden:

• In welchem Organismus (z. B. E. coli, Hefe, CHO-Zellen) wird das Gen exprimiert?

• Welche Anforderungen hat das Protein? (z. B. Glykosylierung, Faltung, Sekretion) Diese Entscheidung beeinflusst Ausbeute, Funktion und Kosten.

Schnelles Testen von vielen Varianten gleichzeitig.

• Ziel: In sehr kurzer Zeit tausende Proteinvarianten testen.

• Wird z. B. bei gerichteter Evolution genutzt.

• Erkennung von „Hits“ (aktive oder verbesserte Proteine).

• Automatisierte Pipettier- und Analyseverfahren (z. B. Mikrotiterplatten).

Strukturvorhersage eines Proteins auf Basis ähnlicher Proteine

• Wenn keine 3D-Struktur eines Proteins bekannt ist, nutzt man die Struktur eines ähnlichen (homologen) Proteinsals Vorlage.

• Methode der Computermodellierung.

• Wird genutzt, um zu verstehen, wie ein Protein funktioniert oder bindet.

  
  

Vorhersage, wie ein Ligand (z. B. Substrat) an ein Protein bindet

• Simuliert Bindungsvorgänge zwischen Molekülen (z. B. Enzym + Substrat).

• Liefert Infos zu Bindestellen, Affinität, Orientierung.

• Sehr nützlich beim Rationalen Design von Enzymen oder Medikamenten.

"Film" über das Verhalten von Molekülen im Zeitverlauf

• Simuliert, wie sich Atome und Moleküle bewegen, z. B. bei Temperatur oder in Lösung.

• Zeigt, wie stabil ein Protein ist oder wie es sich bei Substratbindung verändert.

• Ergänzt Docking, um Flexibilität und Realität zu berücksichtigen.

• Weiterentwicklung von Anwendungen und Rechenkapazitäten ermöglicht

wirklichkeitsnahe molekulare Modelle, Simulation in atomarer Auflösung

• Substratspezifität, Chemo-, Regio-, und Stereoselektivität wird auf

molekularer Ebene verständlich

• Entwicklung von Enzymmutanten mit verbesserten Eigenschaften

• Hilft bei Strukturaufklärung von Proteinen

1. Analyse der Proteinstruktur und -funktion (Verstehen, welche Aminosäuren für Aktivität, Stabilität oder Bindung entscheidend sind.)

2. Wissen über Dynamik & Wechselwirkungen (Verstehen, wie sich das Protein bewegt und bindet. Wo genau ändere ich die Aminosäure, damit sich etwas verbessert?)

3. Methode zur gezielten Mutation (Gezielte Mutagenese: exakte Veänderung einzelner Basen)

4. Auswahl eines geeigneten Expressionssystems (Abhängig vom Protein (z. B. braucht es posttranslationale Modifikationen?))

5. Charakterisierung der Proteinvarianten (Analyse der Funktion, Stabilität, Aktivität usw.)