Reparatur mechanismen

Zellzyklusphasen → Zellzyklusdauer Säugetierzelle: 1 Tag

Interphase:

1. G1-Phase → Zellwachstum, Proteinsynthese Vorbereitung auf DNA-Replikation

   ! G1-Checkpoint (Restriktionspunkt) (Bedingungen okay? DNA intakt?) → Entscheidung: Zellzyklus vs. G0 (Ruhe)

2. S-Phase → DNA-Replikation (Chromosomen verdoppelt) → Zentrosom-Replikation → dauer ca. 8h

3. G2-Phase →Vorbereitung auf Mitose (z. B. Mikrotubuli) → Zelle vergrößert Volumen d. Flüssigkeitseinstrom, → Zellkontakte beginnen sich zu lösen

   ! G2/M-Checkpoint

   Replikation vollständig? DNA-Schäden?)

M-Phase (Mitose)

→ Chromosomen werden auf Tochterzellen verteilt

→ Cytokinese: Zellteilung

! Spindel-Checkpoint (Metaphase/Anaphase)

(Chromosomen korrekt an Spindel angeheftet?)

G0-Phase (optional)

→ Ruhestadium

→ Keine Zellteilung, ggf. Rückkehr in G1 möglich

→ bsp. Nervenzellen o. Epithelzellen

• Einfache DNA-Läsionen (nur ein Strang betroffen) → Reparatur: Einfach, da intakter Strang als Vorlage dient

• Einzelstrangbruch (SSB)

  • Basen Modifikation (z. B. Oxidation, Methylierung)

  • Basen Verlust (Apurin-/Apyrimidinstelle, AP-site)

  • Beschädigter Zucker (Desoxyribose instabil)

  • DNA-Protein-Crosslink (einsträngig)

  • Denaturierte Region (Basenpaarung lokal aufgehoben)

• Komplexere DNA-Läsionen (beide Stränge betroffen) → Reparatur: Schwierig, da keine intakte Vorlage

  • Doppelstrangbruch (DSB)

  • Interstrand-Crosslinks (koppeln beide Stränge)

  • Große Deletionen / Chromosomenaberrationen

• Endogen (zelluläre Prozesse)

  1. Replikationsstress

     (z. B. kollabierende Replikationsgabeln)

     • Ursachen:

       ->  Replikation bereits vorhandener Einzelstrangbrüche (SSBs)

       ->  Replikationsgabel-Kollaps

       -> Strukturelle Hindernisse-> durch Dimere, Hairpins, Cross-linking oder R-Loops (RNA:DNA Hybride)

       ->  Fragile Sites

       • DNA-Regionen, die schwer zu replizieren sind

       • sichtbar durch Verlangsamung der Replikation (z. B. mit Aphidicolin)

  2. SSB während Replikation

     → führt zu DSB       

  3. V(D)J-Rekombination

     (Antikörperdiversität durch gezielte DSB in Immunzellen, die durch NHEJ repariert werden)

  4. Freie Radikale

     (z. B. durch Zellatmung)

  5. Topoisomerase-Aktivität

     → gezielte DSB zur Entspannung der DNA → bei fehlfunktion entstehen DSB

  6. Meiose

     → kontrollierte DSBs → fördern Crossing-Over zwischen homologen Chromosomen

• Exogen (äußere Einflüsse)

  • Chemotherapie

    → z. B. Topoisomerase-Inhibitoren (verursachen DSBs bei Replikation)

  • Ionisierende Strahlung (z. B. CT, Röntgen)

    → erzeugt DSBs direkt durch Energieeintrag oder indirekt über freie Radikale

  • Radiomarkierte Medikamente

Replikationsstress (z. B. kollabierende Replikationsgabeln)

→ Ursachen:

• Replikation bereits vorhandener Einzelstrangbrüche (SSBs)

• Replikationsgabel-Kollaps

• Strukturelle Hindernisse -> durch Dimere, Hairpins, Cross-linking oder R-Loops (RNA:DNA Hybride)

• Fragile Sites

  → DNA-Regionen, die schwer zu replizieren sind

  → sichtbar durch Verlangsamung der Replikation (z. B. mit Aphidicolin)

• Die Zelle erkennt den Schaden und löst eine Signalkaskade aus:

  1. Schadens-Erkennung:

     Sensor-Proteine wie ATM und MRN-Komplex erkennen DSB

  2. Signalweiterleitung:

     -> Zelle hat verschiedene Möglichkeiten auf DSB zu reagieren:

     • Zellzyklus-Stopp: Aktivierung von Checkpoint-Proteinen (z. B. p53, Chk1/Chk2)

     • Apoptose → wenn Schaden zu groß oder irreparabel

     • Seneszenz → dauerhafter Wachstumsstopp ohne Teilung

     • Reparatur

       → bevorzugt bei geringem Schaden

       → durch HR (homologe Rekombination) oder NHEJ

       -> dabei kann Reperatur in 2 Wegen erfolgen:

       • korrekt: genomische Integrität wird erhalten,

       • inkorrekt: Krebsentstehung – Karzinogenese, „Tumor-initiierende Zelle“)

• Entscheidung über Zellreaktion: Abhängig von:

  1. Anzahl / Schwere der DSBs

  2. Zeitpunkt im Zellzyklus

  3. Zelltyp (z. B. Stammzelle vs. differenzierte Zelle)

  4. Reparaturfähigkeit der Zelle

DSB-Reparatur Mechanismen

Wahl des Reparaturweges abhängig von Zellzyklusphase:

• NHEJ (Non-Homologous End Joining) > verbindet stumpfe enden ohne sequenzerhaltung > Zellzyklusunabhängig aber primär aktiv G1-Phase – > Schlüsselproteine: Ku70/Ku80, DNA-PKcs, XRCC4, Lig4

  A)      Normales NHEJ

  1. Schneles NEHJ

  2. Langsames NEHJ (resektionsabhängiges

  3. RNA mediated NHEJ

  B) TMEJ (Polθ-mediated end-joining) auch genannt MMej > benötigt Mikrohomologie (-4Bp) und Resektion,

  > vermutl. Zellzyklus-unabhängig

  > Fehleranfällig, aber essenziell in HR-defizienten Zellen

• HR (Homologe Rekombination) > nur aktiv in S/G2-Phase (benötigt Schwesterchromatid) > 2 Unterformen: eine schnelle, reaktionsunabhängige & eine langsamere, reaktionsabhängige

  A) BIR (Break-Induced Replication):

  > DNA-Reparaturweg für einseitige DSBs,

  > z.B. bei Replikationsgabel-Kollaps oder Telomer-Verlust; > sehr mutagen

  B) SDSA (synthesis dependent strand annealing)

  > wichtig in mitotischen zellen

  > durch entwinden des D-loops wird cross over vermieden

• SSA (Single-strand Annealing) > entsteht während Rekombination > erfordert Resektion, benutzt homologe sequenzen > löscht Sequenzen zw. Wdh = mutagen

→ es gibt einen schnellen DSB reparatur mechanismus und einen langsamen

-       In G1:

Langsamer Weg: NEHJ schneller weg: NEHJ

-       In G2: schneller weg: NEHJ

Langsamer weg: HR

• Hauptweg: ATM-abhängige Erkennung (bei HR)

  • MRN – Komplex erkennt DSB & rekrutiert ATM (Kinase) → MRN-Komplex = (MRE11-RAD50-NBS1)

    > MRE11 bindet ssDNA & dsDNA

  • ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) wird aktiviert

  • ATM phosphoryliert Histon H2AX → Histone bestehen aus 4 Untereinheiten in unterschiedl. Zsmsetzungen. (H1Ax-H4Ax), → manche Histone enthalten H2AX →phosphorylierung H2AX an Serin-139 → γH2AX

  • γH2AX → erzeugt Bindungsplattform für MDC1 → kann mit IF visualisiert werden

  • bindung MDC1 → stabilisiert Signal & rekrutiert weitere ATM & MRN

• Alternativweg: DNA-PK-abhängig (v. a. bei NHEJ)

  • DNA-PK (DNA-PKcs + Ku70/80) erkennt DSB-Enden direkt & bindet an diese (blockiert resektion)

  • Wichtig bei Zellen, die nicht auf ATM angewiesen sind

Wichtige Grundlagen für Resektion:

• Nukleasen

  • Endonukleasen → schneiden innerhalb der DNA

  • Exonukleasen → entfernen Nukleotide vom Ende der DNA

• Helicasen

  • Funktion: lösen Wasserstoffbrücken zwischen DNA-Strängen → Entwindung der Doppelhelix

  • Energiequelle: ATP-Hydrolyse

  • Wichtige HR-Helikasen: BLM, RECQ5, FIGNL1, PARI, FBH1

  wirken teilw. als Anti-Rekombinasen → bauen RAD51-Filamente ab = verhindert übermäßige Rekombination

Ablauf der HR Reparatur:

1. Resektion

   → MRN-Komplex (MRE11-RAD50-NBS1) leitet zusammen mit CtlP resektion ein (aber auch BRCA1)

   → MRE11 (=Endonuklease) schneidet das 5'-Ende → 3′-ssDNA-Überhänge entstehen

2. RPA wird auf ssDNA geladen

3. BRACA2 ersetzt RPA durch Rad51

   → läd Rad51 auf überhängendes (5‘) Ende

   → Formation von Rad51 Filament (dieses kann homologie suche durchführen)

4. Homologie Suche

   → durch Rad51 Filament

   → Homologe sequenz gefunden?

   → bildung eines D-Loops    

   = homologer donor strang öffnet sich, bindung an komplementäre sequenz

5. Innitierung DNA Synthese

   → Rad 54 (DNA Heicase) enfernt rad51 von singlestrandet dna

   → sobald die ssdna an das homologe template gebunden hat

   -> Kopieren der homologen sequenz vom template strang → zwei mögliche synthesearten führen zur Bildung von:

   • Synthesis dependens strand annealing (SDSA) → Holiday junction → nur einer der stränge unerliegt der synthese, → der andere wartet → & wird am ende verbunden

   • Second end capture (SEC) → Double holiday junction → das zweite ende ist in den prozess ebenfalls involviert, → das eine bindet an den einen Strang des D-loops → das andere bindet an den anderen Strang (diplaced strand)

6. auflösen

   → zunächst verschieben des D-Loops → unterschiedl. Je nach syntheseweg

   • SDSA → Holiday junction → nach synthese bindet neu synthetisierter Strang an das bruchende des 2ten Überhängendes Ende des strangs des DSB → anschließend werden die Lücken aufgefüllt

   • SEC → Double holiday junction → auflösen der dhj durch  versch. Wege:

     • Dissolution

       -> Ohne crossing over

       1. Zusammenführen der Holliday junctions → durch BLM

       2. Schneiden der DHJ → eines Stranges → durch TopIII

     • Resolution

       -> Mit crossing over (Sister chromatid exchange) -> Endonucleasen schneiden die DHJ

       -> zwei möglichenkeiten wie geschnitten werden kann:

       1. Ein SCE

       2. SCE

→ Ursprüngliche Sequenz soll erhalten bleiben

-> benötigt homologes Template (z.B. das homologe Chromosom = das zweite Allel, oder in der G2 Phase der Schwesterstrang)

1. Resektion

2. RPA wird auf ssDNA geladen

3. BRACA2 ersetzt RPA durch Rad51 → bildung Rad51 Filament

4. Homologie Suche & Strang Invasion → formation eines D-loop

5. Innitierung DNA Synthese

   → zwei mögliche synthesearten führen zur Bildung von:

   a.      Synthesis dependens strand annealing (SDSA) → Holiday junction

   b.      Second end capture (SEC) → Double holiday junction

6. auflösen

   → unterschiedl. Je nach syntheseweg

   a.      SDSA → Holiday junction → nach synthese bindet neu synthetisierter Strang an das bruchende des 2ten Überhängendes Ende des strangs des DSB → anschließend werden die Lücken aufgefüllt

   b.      SEC → Double holiday junction → auflösen der dhj durch  versch. Wege:

   • Dissolution -> Ohne crossing over

   • Resolution -> Mit crossing over (Sister chromatid exchange)

     
     

Erkenntnisse aus experimenten: ! HR is nicht relevant in G1, aber dafür umso wichtiger in G2

→ Bindung 53BP1an yH2AX verhindert HR Reparatur -> indem es Bindung von MRN Komplex blockiert

1. Rekrutierung MRN Komplex  (short-range Resektion)

   -> MRN-Komplex: Besteht aus MRE11, RAD50 und NBS1.

   • MRE11: Endonuklease und Exonuklease, schneidet DNA-Enden.

   • RAD50: ATPase, hält die DNA-Enden zusammen (Tethering).

   • NBS1: Adapterprotein, rekrutiert andere Reparaturfaktoren.

2. Rekrutierung CtlP

   -> CtIP: Wird phosphoryliert und dann rekrutiert (z. B. durch CDKs)

   = Einleitung der resektion

   → Endonuklease aktivität

3. CltP Kooperiert mit MRE11

   -> schneiden DNA 5’-seitig des DSB

   -> Anschließend Exonuklease-Aktivität von MRE11 in Richtung der Bruchstelle.

   = Ergebnis: Bildung eines kurzen 3'-ssDNA-Überhangs.

4. Langreichweitige Endresektion

   Zwei alternative Wege zur Verlängerung des 3'-ssDNA-Überhangs:

   1. EXO1 (5' → 3' Exonuklease)

      → verlängert 3′-Überhänge

   2. DNA2 + BLM oder WRN (Helikasen)

      → BLM-Helikase entwindet dsDNA→ DNA2 schneidet ssDNA-Abschnitte ab

      = Ergebnis: langer 3'-ssDNA-Überhang

5. Bindung von RPA an ssDNA

   (replacation Protein A)

   → Schutz der ssDNA vor Abbau

   -> Verhindert sekundäre Strukturen

   -> Bereitet die ssDNA auf die Rad51-Beladung vor

   -> bindet immer an ssDNA →daher marker für resektierte DSB

• nach resektion tauscht BRCA das RPA durch Rad51 aus:

  -> 1 Rad51 bindet an 3 Nukleotide

  -> dadurch bildung Rad51 Filament

  = es versteift die ssDNA & macht breit für Homologisuche

• Homologiesuche

  -> Sekundäre Bindungsstelle des Filaments interagiert mit dsDNA (intakte Schwesterchromatide).

  -> Ziel: Finde homologe Sequenz im Template-Strang.

• Basenpaarung und Stranginvasion

  -> Sobald komplementäre Basenpaarung erkannt wird:

  -> Stranginvasion = D-Loop-Bildung

  -> ssDNA paart sich mit der homologen Sequenz (Template-DNA.) → Watson-Crick-Basenpaarung entsteht

  ! Ohne Rad51 kann ssDNA nicht effizient nach homologen Sequenzen suchen

• Entfernung RAD 51 Filament

  -> Verbleib auf der DNA nach Rekombination kann die Replikation behindern & genomische Instabilität fördern

  -> deshalb Dissoziation durch Helicase-Proteine

  -> Helikasen &Regulatoren zur RAD51-Filam. entfernung:

  • BLM, RECQ5, FANCM, FANCJ

  • FBH1, Srs2, Sgs1

  • FIGL1, PARI

  -> Diese wirken anti-rekombinogen, indem sie RAD51 von ssDNA verdrängen.

→ formation einer Holiday junction

A. Replikation wird behindert durch bsp dimer Bildung

B. Neu synthetisierter Strang (rot) entkoppelt sich von originalem Template

C. & bindet an neu synthetiesrten anderen Strang (rot & rot)

→ bilden eine 4way juncion = nennt sich chicken foot = oder auch Holiday junction

D. Lösung des replikationsstress durch verschiedene wege

• Migration replikationsgabel kann rückwärts bewegt werden → weg von behinderung

  → dadurch können reparaurproteine zugriff auf diese Selle erhalten & sie reparieren

• Umgehen der behinderung → das längere 5’Ende wird als template benutzt

→ schneller Weg: Einfaches Verknüpfen der DNA-Bruchenden →Keine Sequenz Erhaltung = Keine Homologie-suche, um DNA-Brüche mit homologen Sequenzen aufzufüllen = zusammenfügen, ohne die ursprüngliche Sequenz zu erhalten

→ 2 Arten:

A) schnelles NHEJ →Klassisches c-NHEJ (Resektions-unabhängig)

1. DSB entsteht

2. Ku79/80 → Freie DSB Enden werden gebunden d. Ku-Komplex (=Heterodimer aus Untereinheiten Ku70 & Ku80)

3. DNA PK bildung → Ku Komplex bildet zsm mit DNA-PKCS (catalytic subunit of DNA protein kinase) ein Trimer (DNA-PK: Dimer + DNAPKCs = Trimer) → schützt die Enden vor Degradation durch Nukleasen

4. DNA-PK phosphoryliert downstream Reparatur-Faktoren → DNA-PK =Kinase, d.h. sie phosphoryliert & aktiviert sich selbst  & andere für die Schadensantwort relevante Zielproteine (z. B. Artemis, XRCC4)

5. Komplex aus XRCC4/LIG4/Xlf sorgt für direktes verbinden der beiden DNA Enden (bridge the break ends & ligase them)

   • LIG4 (DNA-Ligase IV) → Führt Ligation (Verknüpfung) der DNA-Stränge durch. → knüpft Phosphodiesterbindung zw. den DNA-Enden unter ATP verbrauch.

   • XRCC4 (X-ray repair cross-complementing protein 4)

     → Scaffold-Protein (Gerüstprotein) → Fördert die lokale Rekrutierung von LIG4 an DSB. → Schützt LIG4 vor proteolytischem Abbau

   • XLF (XRCC4-like factor, auch Cernunnos genannt)

     → Bindet an XRCC4 → bildet "Brücke" zwischen DNA-Enden.

     → Unterstützt die Synapsis (räumliche Annäherung) der beiden DNA-Enden

B) langsames NEHJ → Resektions-abhängiges c-NHEJ  

1. DSB entsteht

2. Ku70/80

3. DNA PK bildung

4. Resektion → initiierung durch CltP → pRPA abhängig

5. Mre11exo & Exo 1 → funktion?

6. Artemis

   → Schneidet überhängende enden ab → vermutl. Verhindet es dadurch bildung von foldbacks oder hairpin der DNA

C) RNA mediated NHEJ

→ bereits vorhandene RNA, die die gleiche sequenz entählt wie das stück in dem der DSB ist

→ nur für DSBs die in Genen liegen (denn nur hiervon gibt es RNA)

→ RNA dient dann als Template für DSB reparatur

1.        Resekion → pRPA abhängig

-> durch beispielsweise BRACA 2 Knockout -> Eigenschaften:

·         Normaler HR reparaturweg gestört, da RAD52 nicht mehr an Einzelstrang gebunden wird

·         BRCA2-defiziente Zellen haben deshalb Alternative Reparatur Mechanismen: SSA, TMEJ

·         Durch RAD52 oder Polq Inhibition entstehen genotoxische Effekte wie Chromosomenverlust oder mikronukleiverlust = ist letal (RAD52/ Polq Inhibition ist letal für BRCA defiziente Zellen)

-> Alle Tumoren haben immer eine Art HR Defizienz

→ durch resolvase (eine endonuklease)

→ diese schneidet Holliday junction auseinander in 2 Wegeen:

1. Ursprüngliche konfiguration bleibt erhalten

2. crosing over

1. durch replikationsstress bilde sich Holiday junction

2. Holiday junction wird aufgeschnitten

   = Gebrochene replikationsgabel bildet sich

3. Resektion

   → ein Teil des 5‘ DSB Endes wird entfernt, dadurch entsteht langes überhängender 3‘ Ende

4. Rad 51 bildet Filament um 3‘-Ende

   → dieses sorgt für enormes strecken der DNA

5. Homologie suche durch Rad51  

   → um hier erneut mit der Replikation zu starten → es entsteht ein D-Loop (Displacement loop) → dafür macht Rad51 Filament watson&crick Baseparring

6. DNA polymerase wird rekrutiert

   → normalerw. Polq → für BIR werden Polymerasenuntereinheiten verwendet die in der normalen replikation unwichtig sind, aber für den erneuten replikationsstart während BIR relevant sind → z.B. Pol32 (=eine untereinheit von Polq)

7. Replikation wird fortgesezt

   → mit neuem Template

→ verwenden kurze Homologien und sind fehleranfälliger

1.       MMEJ (Microhomology-mediated end joining)

2.       TMEJ (Theta-mediated End Joining)

→ Ist der klassische schnelle NHEJ blockiert:  wird Resektions Maschinerie aktiviert

1.      PlK3 wird akiviert

2.      Das aktiviert CtlP

3.      Dadurch Aktivierung Exo1 -> Exo 1 exprimiert einzelnen DNA-Strang

Lösung Replikationsstress durch replication fork regression → formation einer Holiday junction

1. Replikation wird behindert durch bsp dimer Bildung

2. Neu synthetisierter Strang (rot) entkoppelt sich von originalem Template

3. & bindet an neu synthetiesrten anderen Strang (rot & rot) → bilden eine 4way juncion = nennt sich chicken foot = oder auch Holiday junction

4. Lösung des replikationsstress durch verschiedene wege

   • Migration replikationsgabel kann rückwärts bewegt werden → weg von behinderung → dadurch können reparaurproteine zugriff auf diese Selle erhalten & sie reparieren

   • Umgehen der behinderung → das längere 5’Ende wird als template benutzt