Methoden

Grundsätzliche Methoden:

·         Messen der Gene Expression

o   qPCR, digital PCR, RNA-FISH, northern Blot

·         Messen der Protein Expression

o   WB, IF, flow cytometrie, mass spectometry

o   Identifizieren der Protein Lokalisation ? nicht zu gehört

·         Modulieren der gen expression -> Meist über Plasmide: -> was kann eingefügt werden:

o   siRNA,

o   einfügen einer Mutation (meist cripsr cas mediated) Knockout, knockdown (Bsp inserieren eines Stop Codon)

§  CRISPR-A und CRSPRI -> es ist sehr einfach CRIPS zu mutieren, zu kann das Bindungsverhalten verändert werden -> man kann es zu einer Repressionsdomaine oder Aktivierungsdomaine programmieren – so hat man einen zusätzlichen Transkriptionsfaktor

o   induceble promotor

o   shRNA (Zellen produzieren siRNA selbst)

o   cDNA

·         Transfer (nucleic acids) into cells:

-> welche wege haben wir um DNA in Zellen zu bekommen:

o   Plasminde

o   Virus (biological insertion):

§  Lentivirus -> Genome wird in wirtsgenom integriert

§   z.b.Adenoviren -> wird nicht eingefügt, degradiert über die Zeit

o   Lipofektion (chemical insertion?)

o   Elektroporation (physical insertion)

·         Modulieren von Protein aktivität

o   Inhibitoren (kleine organische Moleküle binden an aktivitätszentrum) modulieren die Expression des Proteins, exprimieren der proteindomaine

·         Identifizieren von Protein interaktionen

o   IP ( immunoprespitation) Antikörper bindet an Proteinkompkex Exkurs: es gibt auch CHIP: Chromatin involviert, deshalb nicht für Proteinmodulation)

o   Tag protein

o   Identifizieren von protein-DNA interaktion

1.         HR Reporter Systems

2.         qPCR

3.         ssDNA vs dsDNA

4.         D-Loop assays

5.         DR-GFP System

6.         Scully System

→ GFP Reporter System um Reparaturmechanismus zu klassifizieren

1.      kaputtes GFP wird eingefügt → geteilter GFP Assaybeider

2.      dann wird synthetisch ein DSB gesetzt → Enzym welches den DSB schneidet: I-Scel = endonuklease

3.      Zelle repariert DSB → je nach Methode leuchtet anschließend  das GFP (oder nicht) = Nachweis eines erbrachten Reparaturmechanismus

1. A) HR (Homologe Rekombination):

   1. SceGFP enthält eine I-SceI-Schnittstelle und eine defekte GFP-Kopie (iGFP) → durch I-SceI-Schnittstelle funktioniert das SCE GFP nicht (=kaputt = keine Floureszenz) → das iGFP auf der gleichen DNA ist ebenfalls defekt (hat keinen Promotor = keine Floureszenz)

   2. Dann setzt I-SceI seinen Schnitt I-Scel schneidet in Scel Schnittstelle(also mitten in GFP)

   3. Repariert Zelle den entstandenen DSB → falls mit HR wird das vollständiges GFP wiederhergestellt = grüne floureszenz

      • für die SceGFP Reparatur wird das iGFP als Template verwendet. → Dies enthält eine vollständige funktionierende GFP Sequenz, nur der promotor fehlt

      • diese GFP Sequenz wird kopiert & das SceGFP wird funktional ( → es hatte selbst ja bereits einen eigenen Promotor und zsm mit der reparierten Sequenz wird es funktionstüchtig

   B) SSA (Single-Strand Annealing):

   1. Zwei GFP-Teile mit überlappenden Homologien → also beide GFP-Teile enthalten einen jeweils identischen Bereich = eine homologe Sequenz (genau gleich auf beiden Seiten)

      • Ein GFP-Fragment links (am 5'-Ende)

      • Ein GFP-Fragment rechts (am 3'-Ende)

   →die ca 300 bp lange identische (homologe) Sequenz der beiden kommt z. B. aus dem mittleren Teil von GFP

   1. I-SceI induziert DSB

   2. SSA führt zur 2,7 kb Deletion → durch resektion abbau der Enden → das ermöglicht aneinander binden (Annealen) der überlappenden Sequenzen → & anschließendes zusammenfügen → dabei wird Der mittlere Teil (inkl. I-SceI-Stelle, Stoppcodon etc.) gelöscht (z. B. 2,7 kb Deletion).

   3. GFP wiederhergestellt

   C) A-NHEJ (Alternative NHEJ):

   1.       Der Schnitt durch I-SceI hinterlässt kurze gleiche Enden (Mikrohomologien).

   2.       Wenn die Zelle A-NHEJ nutzt, verbindet sie diese Enden mit kleiner Deletion.

   3.       Dadurch wird das GFP-Gen wieder funktionsfähig → Zelle leuchtet grün.

   D) NHEJ (klassisch & alternativ):

   1.       Zwei I-SceI-Schnittstellen zwischen Puro und GFP → Das GFP ist vom Promotor getrennt durch zwei Schnittstellen.

   2.       DSB wird durch C-NHEJ (präzise) oder A-NHEJ (mit kleiner Deletion) repariert → Wenn die Zelle die Enden einfach wieder zusammenklebt (mit oder ohne Fehler),

   kommt GFP wieder unter Kontrolle des Promotors. = funktionelles GFP = grüne floureszenz

   3.       GFP-Restauration zeigt erfolgreiche Reparatur

1.       Auf der DNA befinden sich zwe i defekte GFP-Kopien in direkter Wiederholung (direct repeat): → Die obere hat eine I-SceI-Schnittstelle im 5’-GFP → dadurch ist sie kaputt (kein funktionelles GFP) → Die untere ist eine intakte, aber nicht exprimierte GFP-Kopie (kein Promotor)

2.       I-SceI schneidet im oberen GFP → es entsteht ein DSB (Doppelstrangbruch)

3.       Die Zelle repariert den Bruch: → Falls sie homologe Rekombination (HR) nutzt, verwendet sie die untere GFP-Kopie als Reparaturvorlage → Diese Sequenz wird kopiert, um das kaputte obere GFP zu reparieren

4.       Dadurch entsteht ein funktionierendes GFP-Gen, da es: → jetzt eine intakte Sequenz enthält → bereits einen Promotor besitzt

5.       → GFP wird exprimiert = grüne Fluoreszenz → erfolgreicher Nachweis von HR

1.       Zwei Schwesterchromatiden enthalten jeweils eine defekte GFP-Kopie:

→ Der obere Strang (1. Schwesterchromatid) hat:

·         Kaputtes GFP mit I-SceI-Stelle

·         Marker-Bereich: B und A

→ Der untere Strang (2. Schwesterchromatid) hat:

·         Eine 5’-Tr-GFP-Sequenz (als Reparaturvorlage)

·         Marker-Bereich: B, A und ein zusätzliches B

·         Blasticidin-Resistenz (BlsR) liegt hinter dem zweiten B

2.       I-SceI schneidet im oberen GFP → es entsteht ein DSB

3.       Zelle repariert mit homologer Rekombination (HR) unter Nutzung des zweiten Chromatids als Vorlage

4.       Es gibt zwei mögliche Reparaturergebnisse:

·         (1) Short-Tract Gene Conversion (STGC, <1 kb): → Nur das GFP + Marker A wird kopiert → GFP+, aber kein Blasticidin-Resistenzgen übernommen → Zelle ist GFP+, aber BlsR−

·         (2) Long-Tract Gene Conversion (LTGC, >1 kb): →GFP + Marker A und zweites B und Blasticidinresistenz werden kopiert → Zelle ist GFP+ und BlsR+

5.       → Man kann dadurch nicht nur HR nachweisen (GFP+), sondern auch die Länge der Reparatursynthese bestimmen (STGC vs. LTGC)