Methoden

-> Messen der Genexpression

• qPCR (quantitative PCR)

• RT-qPCR (mit reverser Transkription)

• Digital PCR

• RNA-FISH / smFISH (Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization)

• Northern Blot

• Reporter Assays (GFP, Luciferase, etc.)

• Live-Cell Imaging von Reportern (z. B. p53-Reportern)

• Transcriptomics (nicht explizit genannt, aber möglich)

-> Messen der Proteinexpression

• Western Blot (WB / Immunoblot)

• Immunfluoreszenz (IF)

• Durchflusszytometrie (Flow Cytometry / FACS)

• Massenspektrometrie

-> Identifizieren der Proteinlokalisation

• Fluoreszenzmikroskopie

• Live-Cell Imaging (z. B. mit GFP, YFP, CFP)

• Transgene Reporterlinien (z. B. p53-Venus)

-> Modulieren der Genexpression

• Plasmid-basierte Genexpression

• siRNA / shRNA

• CRISPR/Cas9-Knockout

• CRISPRi (CRISPR-Interferenz = Repression)

• CRISPRa (CRISPR-Aktivierung)

• Einfügen eines Stopcodons

• Induzierbare Promotoren (z. B. Shield, TA in dd-I-SceI-GR-System)

• cDNA-Expression

-> Transfer (nukleinsäuren) in Zellen

• Plasmid-Transfektion

• Lentiviren (Integration ins Wirtsgenom)

• Adenoviren (nicht-integrierend)

• Lipofektion

• Elektroporation

-> Modulieren der Proteinaktivität

• Inhibitoren (z. B. PARPi, ATM-/ATR-/DNA-PK-/Chk2-Inhibitoren, Wortmannin, BML-277, etc.)

• Expression mutierter Proteine oder funktioneller Domänen

• Expressionsplasmide (z. B. pMdm2S395A, p21PIPmut)

-> Identifizieren von Protein-Protein-Interaktionen

• Immunpräzipitation (IP)

• Co-IP (Co-Immunopräzipitation)

• Tagging von Proteinen (z. B. FLAG, HA, GFP-Tag)

-> Identifizieren von Protein-DNA-Interaktionen

• ChIP-qPCR (Chromatin-Immunpräzipitation + qPCR)

• ChIP-seq (nicht direkt genannt, aber typisch)

• EMSA (Elektrophoretic Mobility Shift Assay)

• Reporter Assays (z. B. Luciferase, GFP-Reporter mit spezifischen Bindungsstellen

1.       Zwei Schwesterchromatiden enthalten jeweils eine defekte GFP-Kopie:

→ Der obere Strang (1. Schwesterchromatid) hat:

·         Kaputtes GFP mit I-SceI-Stelle

·         Marker-Bereich: B und A

→ Der untere Strang (2. Schwesterchromatid) hat:

·         Eine 5’-Tr-GFP-Sequenz (als Reparaturvorlage)

·         Marker-Bereich: B, A und ein zusätzliches B

·         Blasticidin-Resistenz (BlsR) liegt hinter dem zweiten B

2.       I-SceI schneidet im oberen GFP → es entsteht ein DSB

3.       Zelle repariert mit homologer Rekombination (HR) unter Nutzung des zweiten Chromatids als Vorlage

4.       Es gibt zwei mögliche Reparaturergebnisse:

·         (1) Short-Tract Gene Conversion (STGC, <1 kb): → Nur das GFP + Marker A wird kopiert → GFP+, aber kein Blasticidin-Resistenzgen übernommen → Zelle ist GFP+, aber BlsR−

·         (2) Long-Tract Gene Conversion (LTGC, >1 kb): →GFP + Marker A und zweites B und Blasticidinresistenz werden kopiert → Zelle ist GFP+ und BlsR+

5.       → Man kann dadurch nicht nur HR nachweisen (GFP+), sondern auch die Länge der Reparatursynthese bestimmen (STGC vs. LTGC)

1.       Auf der DNA befinden sich zwe i defekte GFP-Kopien in direkter Wiederholung (direct repeat): → Die obere hat eine I-SceI-Schnittstelle im 5’-GFP → dadurch ist sie kaputt (kein funktionelles GFP) → Die untere ist eine intakte, aber nicht exprimierte GFP-Kopie (kein Promotor)

2.       I-SceI schneidet im oberen GFP → es entsteht ein DSB (Doppelstrangbruch)

3.       Die Zelle repariert den Bruch: → Falls sie homologe Rekombination (HR) nutzt, verwendet sie die untere GFP-Kopie als Reparaturvorlage → Diese Sequenz wird kopiert, um das kaputte obere GFP zu reparieren

4.       Dadurch entsteht ein funktionierendes GFP-Gen, da es: → jetzt eine intakte Sequenz enthält → bereits einen Promotor besitzt

5.       → GFP wird exprimiert = grüne Fluoreszenz → erfolgreicher Nachweis von HR

1. A) HR (Homologe Rekombination):

   1. SceGFP enthält eine I-SceI-Schnittstelle und eine defekte GFP-Kopie (iGFP) → durch I-SceI-Schnittstelle funktioniert das SCE GFP nicht (=kaputt = keine Floureszenz) → das iGFP auf der gleichen DNA ist ebenfalls defekt (hat keinen Promotor = keine Floureszenz)

   2. Dann setzt I-SceI seinen Schnitt I-Scel schneidet in Scel Schnittstelle(also mitten in GFP)

   3. Repariert Zelle den entstandenen DSB → falls mit HR wird das vollständiges GFP wiederhergestellt = grüne floureszenz

      • für die SceGFP Reparatur wird das iGFP als Template verwendet. → Dies enthält eine vollständige funktionierende GFP Sequenz, nur der promotor fehlt

      • diese GFP Sequenz wird kopiert & das SceGFP wird funktional ( → es hatte selbst ja bereits einen eigenen Promotor und zsm mit der reparierten Sequenz wird es funktionstüchtig

   B) SSA (Single-Strand Annealing):

   1. Zwei GFP-Teile mit überlappenden Homologien → also beide GFP-Teile enthalten einen jeweils identischen Bereich = eine homologe Sequenz (genau gleich auf beiden Seiten)

      • Ein GFP-Fragment links (am 5'-Ende)

      • Ein GFP-Fragment rechts (am 3'-Ende)

   →die ca 300 bp lange identische (homologe) Sequenz der beiden kommt z. B. aus dem mittleren Teil von GFP

   1. I-SceI induziert DSB

   2. SSA führt zur 2,7 kb Deletion → durch resektion abbau der Enden → das ermöglicht aneinander binden (Annealen) der überlappenden Sequenzen → & anschließendes zusammenfügen → dabei wird Der mittlere Teil (inkl. I-SceI-Stelle, Stoppcodon etc.) gelöscht (z. B. 2,7 kb Deletion).

   3. GFP wiederhergestellt

   C) A-NHEJ (Alternative NHEJ):

   1.       Der Schnitt durch I-SceI hinterlässt kurze gleiche Enden (Mikrohomologien).

   2.       Wenn die Zelle A-NHEJ nutzt, verbindet sie diese Enden mit kleiner Deletion.

   3.       Dadurch wird das GFP-Gen wieder funktionsfähig → Zelle leuchtet grün.

   D) NHEJ (klassisch & alternativ):

   1.       Zwei I-SceI-Schnittstellen zwischen Puro und GFP → Das GFP ist vom Promotor getrennt durch zwei Schnittstellen.

   2.       DSB wird durch C-NHEJ (präzise) oder A-NHEJ (mit kleiner Deletion) repariert → Wenn die Zelle die Enden einfach wieder zusammenklebt (mit oder ohne Fehler),

   kommt GFP wieder unter Kontrolle des Promotors. = funktionelles GFP = grüne floureszenz

   3.       GFP-Restauration zeigt erfolgreiche Reparatur

→ GFP Reporter System um Reparaturmechanismus zu klassifizieren

1.      kaputtes GFP wird eingefügt → geteilter GFP Assaybeider

2.      dann wird synthetisch ein DSB gesetzt → Enzym welches den DSB schneidet: I-Scel = endonuklease

3.      Zelle repariert DSB → je nach Methode leuchtet anschließend  das GFP (oder nicht) = Nachweis eines erbrachten Reparaturmechanismus

1.         HR Reporter Systems

2.         qPCR

3.         ssDNA vs dsDNA

4.         D-Loop assays

5.         DR-GFP System

6.         Scully System

Mikroskopische Methode zur Detektion von DSBs durch Anfärbung von DNA-Schadensmarkern (z. B. γH2AX, 53BP1, pRPA, RAD51). Die Anzahl der Foci korreliert mit der Anzahl der DSBs. pRPA-Foci zeigen Resektion an. Automatisierte Auswertung mit Tools wie AutoFoci möglich.

Visualisierung chromosomaler Aberrationen wie Brüche, Fusionen, Mikronuklei. PCC erlaubt Darstellung von Chromosomen auch außerhalb der Mitose. Zellen werden metaphasen-arrestiert (Colcemid), hypoton behandelt und fixiert.

Zur Quantifizierung von DNA-/RNA-Leveln oder Nachweis von DSBs (Signal↓ bei Bruch). Mit ChIP-qPCR lassen sich Protein-DNA-Interaktionen (z. B. p53, γH2AX) und Histonmodifikationen nachweisen.

siRNAs und shRNAs führen zur gezielten Degradation von mRNA, um Genexpression zu reduzieren. Dient der Funktionsanalyse von Genen wie BRCA2, POLθ, RAD52 usw.

Beobachtung lebender Zellen über Zeit mit fluoreszierenden Reportern (z. B. p53-YFP). Gemessene Parameter: Pulsamplitude, Dauer, Timing zellulärer Prozesse (z. B. p53-Oszillationen).

Zur gezielten Induktion von DNA-DSBs. NCS und CPT simulieren Strahlungseffekte. CPT hemmt Topoisomerase I und erzeugt replikationsassoziierte DSBs.

Nachweis und Quantifizierung spezifischer Proteine nach Größe mittels SDS-PAGE und Antikörpern. Erfasst z. B. p53-Level, Phosphorylierung, Knockdown-Effizienz (z. B. durch siRNA).

Expression veränderter Proteinvarianten (z. B. p21PIPmut) zur Untersuchung spezifischer Domänen oder Modifikationen. Zeigt z. B. Stabilität oder Aktivitätsveränderungen in Zellzyklus oder DNA-Reparatur.

EdU/BrdU-Markierung identifiziert Zellen in der S-Phase. DAPI-Färbung misst DNA-Gehalt. Flow Cytometry (FACS) erlaubt quantitative Analyse von Zellzyklusverteilungen (G1, S, G2/M).

Was misst smFISH und wie wird es eingesetzt

Gruppierung zeitlicher Expressionsverläufe (z. B. von p21) nach Ähnlichkeit. k-shape z. B. unterscheidet 'delayed' vs. 'immediate' Zellantworten auf DNA-Schäden.

Welche Rolle spielen chemische Inhibitoren in der Funktionsanalyse

FAIR: Findable, Accessible, Interoperable, Reusable – für gute Datenpraxis. Elektronische Laborbücher (ELN) sichern nachvollziehbare und strukturierte Dokumentation experimenteller Daten.

Welche Prinzipien gelten für wissenschaftliche Datenvisualisierung

"Genexpression: qPCR, digitale PCR, RNA-FISH, Northern Blot

Proteinexpression: Western Blot, Immunfluoreszenz (IF), Flow Cytometry, Massenspektrometrie"

Wie kann die zelluläre Lokalisation von Proteinen bestimmt werden

"1. Plasmide (chemisch)

2. Viren: Lentiviren (integrierend), Adenoviren (nicht-integrierend)

Mit spezifischen Inhibitoren (kleine Moleküle) oder Expression modifizierter Proteindomänen.

"1. Immunpräzipitation (IP)

2. Tagging von Proteinen zur Co-Purifikation

CHIP analysiert Protein-DNA-Interaktionen, nicht Protein-Protein."

"1. Chromatin Immunpräzipitation (ChIP)

2. EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)

3. Reporter-Assays (z. B. GFP-, Luciferase-Reporter)"

"Konventionelle PCR: Endpunktnachweis, keine Mengenangabe.

Real-Time PCR: Echtzeit-Quantifizierung über Fluoreszenz (Ct-Wert), entweder SYBR Green (unspezifisch) oder TaqMan (spezifisch)."

Durch Kolokalisation von Fluoreszenzmarkern (z. B. 53BP1-mCherry & γ-H2AX). Automatisierte Bildanalyse liefert quantitative DSB-Zählung pro Zelle.

Live-Tracking mit fluoreszierenden Reportern (z. B. p53-Venus). Zeitraffermikroskopie und Softwareanalyse ermöglichen die Auswertung von Amplitude, Dauer, Frequenz.

"1. Zink-induzierte Isolierung von p53–Mdm2 zeigt schwache Oszillation

2. ATM/Chk2 zeigen oszillierende Phosphorylierung

3. Modell mit zusätzlichem Wip1-Loop bestätigt stabile Pulsbildung

4. Stabiler Mdm2-Mutant (S395A) verhindert Puls → Feedback nötig"

"1. Einzelzell-Imaging mit p53-Venus nach NCS zeigt konstante Pulsamplitude

2. Nur Pulsanzahl steigt mit Schadensdosis

3. Statistische Analyse: Amplitude & Dauer konstant → digital"

"1. p53-Pulse bei wenigen DSBs beobachtbar

2. p53-Aktivierung korreliert kontinuierlich mit DSB-Zahl

3. Statistik & Verteilungsanalysen bestätigen stetige (nicht schwellwertartige) Antwort"

"Ein molekularbiologisches Werkzeug zur kontrollierten Induktion von DSBs in eukaryotischen Zellen.

Es besteht aus I-SceI (Endonuklease), dd (Destabilisierungsdomäne), GR (Glucocorticoid-Rezeptor-Domäne).

→ Shield-1 stabilisiert das Protein, TA (Triamcinolon-Acetonid) führt zur Translokation in den Zellkern.

→ Dort schneidet I-SceI an spezifischen Stellen und erzeugt synchrone DSBs."

"Zwei defekte GFP-Kopien auf der DNA. I-SceI induziert DSB im oberen GFP.

"Zwei Chromatiden mit defekten GFPs & Blasticidin-Resistenzexons A und B.

STGC: Nur GFP kopiert → GFP+, BsdR−

LTGC: Auch A&B kopiert → GFP+, BsdR+

→ HR und Länge der Reparaturstrang-Synthese erkennbar."

"D-Loop entsteht nach DSB und Homologiesuche durch RAD51.

→ D-Loop wird durch Psoralen-Crosslinking stabilisiert.

→ DNA ligiert (Proximity Ligation), qPCR erkennt chimäre Produkte → D-Loop Nachweis."

"qPCR-Primer flankieren I-SceI-Schnittstelle.

→ Ohne Schnitt: starke Amplifikation.

→ Mit DSB: Region zerstört → weniger oder kein PCR-Produkt → niedriges Signal."

"→ DpnII schneidet nur dsDNA.

→ Nach Resection wird DNA ss → DpnII kann nicht schneiden.

→ qPCR liefert hohes Signal bei resektionierter DNA, niedriges bei ungeschnittener dsDNA."

"A) HR: Reparatur mit homologer Vorlage → GFP+

B) SSA: Annealing über Homologien → GFP+

C) A-NHEJ: Mikrodeletions-Reparatur → GFP+

D) NHEJ: direkte Endverknüpfung → GFP+

E) DR-GFP & Scully-System: Unterscheidung von HR-Modi."

"→ ssDNA: einzelsträngig, entsteht bei Resection

→ dsDNA: doppelsträngig, intakte DNA

→ Unterschied z. B. durch DpnII-Verdau: schneidet nur dsDNA → indirekter Nachweis von Resection."