synthetische Lethalität

→ Synthetische Letalität beschreibt den Zustand, bei dem der gleichzeitige Verlust zweier Gene zum Zelltod führt, während einzelne Defekte jeweils überlebbar sind.

→ Das Konzept wird u. a. zur gezielten Krebstherapie genutzt (z. B. BRCA/PARP)

• Synthetic lethality: Die Verarmung von Rad52 in BRCA2-defizienten Zellen „mildert den Reparaturdefekt in Abwesenheit von BRCA2“, aber „auf Kosten der Genomintegrität“, was zu einer Anhäufung von Chromosomenfusionen führt, einem Zeichen für End-Joining-Mechanismen.

• Regulatorische Funktion: Das Modell legt nahe, dass RAD52 die „rechtzeitige Aktivierung von POLθ“ reguliert. Es „fördert nicht, sondern verhindert die Aktivierung eines alternativen Weges“ - es verhindert die vorzeitige Nutzung von alt-EJ und begrenzt dadurch die Bildung von genomischen Umlagerungen in BRCA2-defizienten Zellen.

• Entgegengesetzte Rolle zu den Annahmen: Entgegen der Erwartung, dass Rad52 Rad51 als HR-Vermittler belastet, scheint es in Abwesenheit von BRCA2 eine eher hemmende Rolle bei alternativen Reparaturwegen zu spielen.

• Verzögerte Reparatur bis zur Mitose:

  -> DSBs, die an Replikationsgabel entstehen, sind während S/G2-Phasen schwer reparierbar

  ->Reparatur durch Polθ (alt-EJ) ist eingeschränkt

  -> Reparatur wird "delayed until mitosis".

• Vorteil der Verzögerung von alt-NHEJ bis zur Mitose:

  -> das zweite Bruchende könnte von einer sich nähernden Replikationsgabel erzeugt werden

  -> der Prozess der Chromatinkondensation stellt die richtigen Bruchenden nebeneinander

  -> ermöglicht präzisere Verknüpfung ermöglicht.

• Polθ und PARPi-Resistenz:

  -> PARP1 kann Brüche während der Mitose in Abwesenheit von BRCA2/RAD51 nicht vollständig beheben, da Zellen weiterhin Polθ-vermittelte alt-EJ nutzen können.

→ PARP1: repariert SSBs; Hemmung bei BRCA2-Mutation

→ DSB-Akkumulation → Zelltod→ Synthetische Letalität: PARP1 & BRCA2 → gezielte Therapie bei HR-Defizienz

→ Resistenzproblem: Zellen finden alternative DSB-Reparaturwege

→ Weitere synthetisch letale Partner:

• POLθ: wichtige Rolle bei Endverbindung ohne BRCA2 → Kombi mit PARPi ↑ Wirksamkeit

• RAD52: synthetisch letal mit BRCA1/2 & PALB2 (trotz geringer Funktion allein)

• CIP2A: Interaktion mit TOPBP1 als potenzielles Target in BRCA-defizienten Tumoren

• Krebsrisiko: Mutationen in BRCA2 (und BRCA1) sind mit einem erhöhten Risiko für Brust- und Eierstockkrebs verbunden. Z.B. liegt das Brustkrebsrisiko für BRCA1/2-Mutationsträgerinnen bei 70/69% im Vergleich zu 12% in der Allgemeinbevölkerung.

• Tumorsuppressor: BRCA2 ist ein Tumorsuppressorprotein, das entscheidend für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität ist. Über 18.000 Mutationen in BRCA2 wurden bei Krebspatienten identifiziert, viele davon Varianten unklarer Signifikanz (VUS).

• Funktionelle Domänen: BRCA2 besitzt verschiedene Domänen, die für seine Funktion unerlässlich sind, darunter

  • BRC-Wiederholungen (binden RAD51),

  • eine DNA-bindende Domäne (DBD),

  • eine Tower-Domäne (DNA-Strangaustausch),

  • eine C-terminale Domäne (stabilisiert RAD51-ssDNA-Filament)

  • & ein nukleäres Lokalisierungssignal (NLS)

→ Was lässt sich mit einem genome-wide CRISPR Knockout Screen identifizieren? Gene, die essenziell für Zellüberleben sind (Knockout = Zelltod) sowie Gene, deren Verlust zu Medikamentenresistenz oder erhöhter Zellfitness führt.

Ablaufschritte:

1. CRISPR gRNA Bibliothek auswählen (z. B. GeCKO v2) → Enthält gRNAs gegen (fast) alle Gene des Genoms. → Jede gRNA wird ein bestimmtes Gen ausschalten.

2. Zellen infizieren (z. B. mit Lentiviren) → Niedrige MOI (Multiplicity of Infection): → jede Zelle bekommt nur eine gRNA → nur ein Gen wird ausgeschaltet.

3. Selektion transduzierter Zellen → z. B. durch Puromycin-Resistenzgen im Vektor → nur erfolgreich infizierte Zellen überleben.

4. Behandlung → z. B. mit einem Medikament, Bestrahlung oder anderen Stressfaktoren. → Ziel: herausfinden, welche Knockouts empfindlich oder resistent machen.

5. DNA isolieren und gRNA-Sequenz analysieren → PCR + Next Generation Sequencing → Wie häufig kommt jede gRNA noch vor?

6. Auswertung (Bioinformatik)

→ RAD54 ist entscheidend für den dHJ-Weg, → RAD51AP1 für SDSA. →  Fehlen beide, versagt die D-Loop-Bildung vollständig und Zellen werden hochsensitiv gegenüber PARP-Inhibition (z. B. Olaparib), was zur synthetischen Letalität führt

-> BLM, SLX4 und GEN1 spielen alle eine Rolle beim Auflösen der HJ

• SLX4 allein fehlt → Zellen überleben.

• BLM oder GEN1 allein fehlen → Zellen überleben.

• ABER: SLX4 fehlt + zusätzlich Knockdown von BLM oder GEN1 (z.B mit siRNA) → Zelltod = synthetische Letalität

→ Olaparib hemmt PARP1

→ verhindert die Reparatur von SSB, die während Replikation zu DSB werden

→ BRCA2−/ Zellen sind HR-defizient und können diese DSBs nicht reparieren

→ was zum Zelltod führt (synthetische Letalität).

–wichtigstes Konzept der zielgerichteten Krebstherapie

→ PARP-Inhibition ist tödlich für Zellen mit BRCA2-Defizienz, da diese keine DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) korrekt reparieren können → synthetisch letaler Effekt

Was passiert bei PARP1-Inhibition?

1. Normalerweise: → PARP1 erkennt und repariert Einzelstrangbrüche (SSBs) → Zelle überlebt

2. Bei PARP1-Inhibition: → SSBs bleiben unrepariert → bei Replikation → Replikationsgabel-Kollaps → DSBs

3. Zellen mit funktionierender HR (z. B. BRCA2 intakt): → reparieren DSBs durch homologe Rekombination → Überleben

4. HR-defiziente Zellen (z. B. BRCA2-Mutation): → können die DSBs nicht reparieren → Zelltod

→ zwei Arten

1. Monotherapie → bei synthetischer Letalität

   • Tumorzellen haben oft bereits defekte DDR-Gene (z. B. BRCA1/2).

   • Wenn man zusätzlich einen weiteren Reparaturweg blockiert, den die Zelle zur Kompensation braucht → synthetisch letaler Effekt → Zelltod

   • Beispiel:BRCA1-defiziente Tumoren → PARP-Inhibition → Tumorzelltod

2. Kombitherapie → mit DNA-Schädigenden Substanzen

   • Viele Chemo/Strahlentherapie erzeugen DNA-Schäden

   • Tumorzellen versuchen, diese Schäden zu reparieren

   • Wenn man die Reparatur zusätzlich blockiert, z. B. mit HR- oder NHEJ-Inhibitoren, bleibt der Schaden bestehen → verstärkter Tumorzelltod

   • Reparatur Inhibitoren:

     • HR Inhibition

       (Targets: MRE11, RAD51, BRCA, RPA, PARP etc.) → stören homologe Rekombination

       Beispiele: → Mirin (MRE11-Inhibitor) → Olaparib (PARP-Inhibitor, in Klinik)

     • NEHJ Inhibition (Targets: DNA-PKcs und andere PI3Ks)

       Beispiele:

       → NU7026, NU7441 (DNA-PKcs-Inhibitoren)

Synthetisch letale Krebstherapie

→ Sie nutzt eine genetische Schwäche in Krebszellen (z. B. Mutation in Gen A),

→ & hemmt gezielt ein zweites Gen (Gen B),

→ aufgrund von synthetischer Letalität stirbt die Tumorzelle (Gen A & Gen B kaputt)

→ die gesunde Zelle überlebt allerdings (Gen A funktioniert & nur Gen B kaputt)

-> Beispiel in der klinik

• BRCA1/2-Mutation (Gen A defekt) → Tumorzellen

• PARP-Inhibition (Gen B gehemmt)

• führt nur in Tumorzellen zum Zelltod, nicht in gesunden

• Mitotische Funktion: Im Interphase-Zellzyklus ist CIP2A zytoplasmatisch. Wenn jedoch die DNA durch ionisierende Strahlung (IR) geschädigt wird, zeigt CIP2A einen „auffälligen Anstieg der IR-induzierten γH2AX-fokussierenden CIP2A-Foci, die ausschließlich in mitotischen Zellen zu sehen sind“.

• Schutz vor Fehlsegregation: BRCA-defiziente Zellen akkumulieren unterreplizierte DNA und transferieren sie in die Mitose. CIP2A und TOPBP1 „verhindern die Fehlsegregation von azentrischen Chromosomen und den Zelltod“.

• Ähnliche Rolle wie RAD52? Die Forschung untersucht, ob CIP2A in BRCA2-defizienten Zellen eine ähnliche regulatorische Rolle wie RAD52 spielt, insbesondere im Hinblick auf die Verzögerung von Reparaturprozessen bis zur Mitose.