Nenne Vor- und Nachteile der rekombinanten Proteinproduktion in E.coli. Was ist va. für therapeutische Proteine zu beachten?
Vorteile
Nachteile
einfaches System (Klonierung, Transformation, Kultivierung)
günstig
schnelles Wachstum
Hochzelldichtekultivierung möglich
Bildung von inclusion Bodies
keine posttranslationalen Modifikationen möglich (N-oder O-Glykosylierungen)
cytoplasmatisch reduzierendes Milieu -> Ausbildung von Disulfidbrücken nur im Periplamsa möglich
Konatminationen durch Wirtsproteine oder Wirts-DNA
Endotoxine in äußerer Membran gramnegativer Bakterien
teilweise Degradation der Zielproteine durch zelluläre Proteasen
Missfolding durch zu schnelle Expression
Bakterielle Endotoxine (Lipopolysccharide) müssen bei therapeutischen Anwendungen unbedingt vermieden werden! Sie wirken proinflamatorisch, schütten IL-1 und TNF-alpha aus und bewirken Fieber, Entzündungen und septischen Schock. Die Endotoxine müssen den gesamten Downstream Process über quantifiziert werden.
Wie lassen sich Endotoxine entfernen?
Ionenaustauschchromatographie
Affinitätschromatographie
Hydrophobe Interaktionschromatographie
Detergensbasierte Extraktionsverfahren
Was sind Bestandteile eines E.coli Expressionssystems? Nenne Beispiele und Funktion.
Origin of replication (ORI): Startpunkt der Replikation, definiert Kopienzahl -> z.B. p15A und pUC
Resistenzmarker: Selektion transformierter Zellen -> z.B. Ampicillin, Kanamycin, Chloramphenicol
Promotor: steuert Transkription des Zielgens, starker & dichter Promotor, um va. bei toxischen Proteinen basale Produktion gering zu halten -> z.B. IPTG
Ribosombindestelle: Initiation der Translation -> z.B. Shine-Dalgarno-Sequenz
Multiple Cloning Site: Restriktionsschnittstellen zum Einfügen des Zielgens
Tag-Sequenz: hilfreich zur Aufreinigung und Detektion des Proteins
Terminatorsequenz: hinter der Tag-Sequenz zur korrekten Beendigung der Transkription, erhöht Stabilität der mRNA -> Hairpin Loop
Was ist polycistronische Produktion und was muss beachtet werden? Welche Alternative gibt es?
mehrere Proteine werden gleichzeitig von einer mRNA gebildet, jedes Gen braucht eine eigene RBS
Alternative: kompatible Plasmide -> flexibler und getrennte Kontrolle möglich
Vergleiche die Expressionssysteme pET und pBAD.
pET
pBAD
etwa 40 Vektoren erhältlich
für 80% der Proteine der PDB genutzt
etwa 20 Vektoren erhältlich
+ große Proteinmengen
+ Induktor IPTG günstig
+ für schwierige Proteine (toxisch oder Membranproteine)
+ Induktionsniveau steuerbar durch Induktorkonzentration -> keine inclusion bodies
- Induktionsniveau nicht steuerbar
- häufig inclusion bodies
- T7-Stamm notwendig
- Induktor Arabinose teuer
- geringe Proteinmengen
- geeigneter Stamm notwendig
Was sind häufige Probleme bei E.coli als Expressionsystem? Wie können sie gelöst werden?
bakterielle Endotoxine
-> Quantifizierung während des gesamten Downstream Process, Entfernung über Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, detergenzbasierte Extraktionsverfahren
Proteolytische Degradation des Zielproteins
-> Protease-defiziente Stämme oder Zugabe von protease-Inhibitoren zum Zellextrakt (EDTA, PMSF, Cocktails,…)
Inclusion Bodies
-> geringere Wachstumstemperatur, gleichzeitige Überproduktion von Chaperonen, Produktion als Fusionsprotein, Rückfaltung, gleichzeitige Überproduktion von seltenen tRNAs
Nenne Beispiele für gängige E.coli Stämme und ihre Anwendung + Mutationen.
DH5α: optimiert für Plasmidpräparationen & Klonierungsarbeiten, ungeeignet für Proteinüberproduktion
-> recA1: inaktivierte homologe Rekombination
-> endA1: inaktivierte Endonuklease
BL21: geeignet für Proteinüberproduktion (nicht für T7 Plasmidsysteme)
-> ompT: inaktivierte Protease OmpT
-> lon: inaktivierte protease Lon
BL21(DE3): geeignet für Proteinüberproduktion mithilfe von t7 Plasmidsystemen
-> ompT
-> lon
-> DE3: Integration des λ(DE3)-Lysogens, enthält Gen für T7-RNA-Polymerase
BL21pLysS: geeignet für Proteinüberproduktion mithilfe von T7 Plasmidystemen, besonders stringente Kontrolle (gut für toxische Proteine)
-> DE3
-> trägt Plasmid pLysS: kontinuierliche Produktion von geringen Mengen T7-Lysozym, was Aktivität der T7 Polymerase hemmt, sodass geringe basale Expression
BL21(DE3)CodonPlus Rp: Proteinüberproduktion mithilfe von T7-Plasmidsystemen, Expression von Genen für seltene tRNAs für Codons AGA,AGG (Arginin), CCC (Prolin)
trägt Plasmid zur Produktion von 2 tRNAs (argU,ProL) zur Überwindung des Codon Bias
BL21Top10: Proteinüberproduktion mithilfe von pBAD Plasmidystemen (Arabinose induzierbar) & Plasmidproduktion/Klonierung
-> ara: umfangreiche Deletion/Mutation im Arabinose-Operon (betrifft Aufnahme & Verstoffwechselung der Arabinose)
BL21Tuner(DE3): Proteinüberproduktion mithilfe von T7-Plasmidsystemen, konzentrationsabhängige IPTG-Induktion
-> lacY: Lactose-Permease (gleichmäßige IPTG-Aufnahme (passiv), fine Tuning der Induktion)
Was kennzeichnet Tags? Was sind Nachteile?
verbesserte Proteinexpression
stark vereinfachte & schnelle proteinreinigung
Abtrennung von degradierten Proteinen möglich
Tags verbessern die Löslichkeit des Zielproteins
können proteolytisch abgeschnitten werden
Nachteile:
mögliche Interaktionen mit Zielprotein
nicht-native Sequenzen sind in der Therapie in der regel nicht zugelassen
Abtrennung des Tags teils problematisch
teure Affinitätsmaterialien
teure Proteasen
Was muss bei der His-Tag Reinigung beachtet werden? Was sind Vorteile von His-Tag?
Vorteile:
sehr klein -> geringer/kein Einfluss auf Zielprotein
preiswerte Elution mit EDTA, Resin oder Imidazol
Reinigung auch unter denaturierenden Bedingungen möglich
Mögliche Probleme:
Verunreinigungen, Affinität von Wirtsproteinen
EDTA ungeeignet für Metalloproteine
Etablierung eines proteinspezifischen Renigungsprotokoll
Aggregation, Inaktivierung durch Imidazol -> Dialyse notwendig
Co2+, Ni2+ -> Vorsicht mit Reduktionsmitteln -> Bildung unlöslicher Sulfide
Was kann man tun, wenn wenig/gar kein Protein gebildet wird?
Verbesserung der mRNA Stabilität, z.B. Schutz vor RNasen, optimierte 5’-u.3’-UTR Bereiche, stärkere Promotoren
Fusionsproteine zur besseren Faltung & Synthese
Beachtung der Codon Usage, z.B. Mutagenese, synthetische Gene (sämtliche Codons werden an E.coli angepasst)
Was kennzeichnte den Glutathion-S-transfearse Tag?
relativ groß
Elution mit 10 mm Glutathion
GST schützt vor Proteolyse & verbessert die löslichkeit
bildet Dimere -> Achtung bei Größenbestimmungen
Entfernung über preScission Protease (sehr teuer) -> Re-Chromatographie notwendig!
Was kennzeichnet Strepatavidin binding tags?
Biotin bindet mit hoher Affinität an Streptavidin
Strep-Tag II Sequenz besitzt hohe Affinität für Strep-Tactin
Twin-Strep-tag besitzt noch höhere Affinität -> ideal für batch purification
Strep-Tactin sehr teuer, aber extrem stabil, wichtig z.B. für regeneration
Elution mit Desthiobiotin, dann regeneration des Säulenmaterials mit HABA
Zuletzt geändertvor 4 Tagen