Prüfungsrelevant

1. Stoff A wird in Stoff P umgewandelt: A ->(k) P

2. Reaktionsgeschwindigkeit proportional zur Stoffkonzentration: Proportionalitätsfaktor k.

3. z.B. Radioaktiver Zerfall oder Fluoreszenzlebensdauer.

4. Reaktionsgeschwindigkeit:

Edukte A und B (ggf. weitere) bilden in Reaktion Produkt P:

A+ B ->(k) P

Reaktionsgeschwindigkeit hängt von der Konzentration beider Reaktanten

Bei enzymatischen Reaktionen muss erst Bindung zwischen Protein Pr und Ligand L stattfinden (häufig imitierender Faktor).

Komplexierung ist reversibel:

Im Gleichgewicht sind damit Komplexbildung und Zerfall gleich:

Da die Geschwindikeitskonstanten k1 (manchmal auch ka) und k-1 (manchmal ka) kaum zu bestimmen sind, fasst man ihr Verhältnis zu einer neuen Konstante zusammen, welche Dissotiationskonstante, Kd genannt wird:

1. Ob im konkreten Fall nun eine Assoziation oder eine Dissoziation stattfindet, hangt von den Konzentrationsunterschieden zwischen Protein und Ligand ab!

2. Die Konzentration des freien Proteins wird durch Dissoziation erhöht und durch Assoziation verringert.

3. Die Konzentration des freien Liganden wird durch Dissoziation erhöht und durch Assoziation verringert.

4. Die Konzentration des Komplexes wird durch Dissoziation verringert und durch Assoziation erhöht.

reversible Protein-Ligand-Bindung um die Produktbildung einer Enzymatischen Reaktion erweitert. Das Protein P nennen wir nun Enzym E und der Ligand L heißt nun Substrat S. Enzym-gebundenes Substrat ES

Die Geschwindigkeit der Produktbildung (Änderung der Produktkonzentration hängt von der Konzentration verfügbare ES ab und ist eine Reaktion erster Ordnung.

Die Proportionalitätskonstanten werden üblichweise zur sog. "Michaeliskonstante" Km zusammengefasst:

In dieser Darstellung, welche Lineweaver-Burk-Darstellung genannt wird, entspricht die Steigung der Geraden Km/Vmax, der Ordinatenschnittpunkt entspricht 1/Vmax und der Absizzenschnittpunkt -1/Km.

Wir betrachten ein Wachstum durch Zellteilung (im Gegensatz zu Sprossung oder Hyphenbildung) unter idealen Bedingungen. Wir nehmen weiterhin an, dass Zellmasse und Zellzahl korrelieren. Durch Teilung entstehen aus den Zellen N nach einer Verdopplungszeit ta doppelt soviele Zellen 2*N. Die Teilung läuft mit der Wachstumsgeschwindikeit µ.

Die Substrat-abhangigkeit von µ wird durch die Monod-Gleichung beschrieben. Als empirisches Modell beruht sie auf der bekannten

Michaelis-Menten-Kinetik v = Vmax*Cs / Cs+Km

Das Substrat S wird genutzt um Biomasse X zu bilden

Ks ist hier die Sättigungskonstante bei der µ max halbmaximal ist und, ähnlich Umaz, eine konstante Eigenschaft der Mikroorganismen. Sie beschriebt, wie schnell das Susbtrataufgenommen werden kann.

1. Gleiche Einheit wie die Substratkonzentration [S] z. B. mg/L, g/L oder mmol/L )

2. Ks = Substratkonzentration, bei der die spezifische Wachstumsgeschwindigkeit μ = 1/2 μmax beträgt

3. Klein Ks: hohe Affinität zum Substrat, Zellen wachsen schon bei niedriger Substratkonzentration fast mit μmax​

4. Groß Ks​: geringe Affinität, Wachstumsgeschwindigkeit steigt erst bei höheren Substratkonzentrationen.

1. Abbauender Stoffwechsel

2. Abbau komplexer Moleküle → einfache Moleküle

3. Energie wird freigesetzt (exergon)

4. Bsp.: Glucoseabbau (Glykolyse, Zitratzyklus, Atmungskette)

• Aufbauender Stoffwechsel

• Synthese komplexer Moleküle aus einfachen Vorstufen

• Energie wird verbraucht (endergon)

• Bsp.: Proteinsynthese, DNA-/RNA-Synthese, Lipidbiosynthese

• Zentraler Abbauweg von Glucose (C₆ → 2 × C₃)

• Findet im Zytosol statt

• Anaerober Prozess (kein O₂ notwendig)

• Endprodukt: 2 Pyruvat

1. Energie-Investitionsphase (Schritt 1–5) → ATP-Verbrauch

2. Energie-Gewinnungsphase (Schritt 6–10) → ATP & NADH-Produktion

Glucose + 2 NAD⁺ + 2 ADP + 2 Pi

→2 Pyruvat + 2 NADH+2H⁺ + 2 ATP + 2 H₂O

• Aerob: Pyruvat → Acetyl-CoA → Zitratzyklus

• Anaerob (Tiere): Pyruvat → Lactat (Milchsäuregärung)

• Anaerob (Hefen): Pyruvat → Ethanol + CO₂ (alkoholische Gärung)

• Anaerober Abbauweg von Pyruvat

• Endprodukt: Milchsäure (Laktat)

• Dient der NAD⁺-Regeneration für die Glykolyse

‚Laktatgärung‘ findet statt in Erythrozyten (besitzen keine Mitochondrien)

Skelettmuskeln unter ‚anaeroben‘ Bedingungen

Krebszelllinien

NADH muss in NAD+ überführt werden, um die Glykolyse aufrecht zu erhalten.

• Alternativer Abbauweg von Glucose-6-phosphat

• Läuft im Cytosol ab

• Zwei Hauptfunktionen:

  • Bereitstellung von NADPH (Reduktionsäquivalent)

  • Synthese von Ribose-5-phosphat (Baustein für Nukleotide, DNA/RNA)

1. Oxidative Phase

   • Glucose-6-P → Ribulose-5-P

   • Bildung von NADPH + CO₂

2. Nicht-oxidative Phase

   • Umwandlung von Zuckern (C3–C7)

   • Bereitstellung von Ribose-5-P oder Rückführung in Glykolyse (Fructose-6-P, Glycerinaldehyd-3-P)

1. Interaktionspartner:

   • Histidinreste (His-Tag, meist 6×His) am rekombinanten Protein

   • Metallionen (Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺) immobilisiert auf einer Chelat-Matrix (z. B. Ni-NTA, Co-IDA)

2. Bindebindungen:

   • Koordinative Bindung zwischen den Imidazol-Seitenketten der Histidine und den immobilisierten Metallionen

3. Elutionsbedingungen:

   • Zugabe von Imidazol (kompetitiver Ligand, verdrängt His-Tag vom Metall)

   • Alternativ: Absenkung des pH-Werts (Protonierung der Histidine → Bindung löst sich)

   • Manchmal: Zugabe von Chelatoren (EDTA), aber meist erst zum Strippen der Säule

• Interaktionspartner:

  • Geladene Proteinoberflächen (abhängig vom pH → Nettoladung)

  • Funktionalisierte Gruppen auf der Matrix:

    • Kationentauscher (negativ geladen, binden positive Proteine)

    • Anionentauscher (positiv geladen, binden negative Proteine)

• Bindebedingungen:

  • pH-Wert des Puffers so eingestellt, dass das Protein die passende Nettoladung trägt

  • Elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Proteinladung und Ionentauschergruppen

• Elutionsbedingungen:

  • Erhöhung der Salzkonzentration (Na⁺/Cl⁻ verdrängen Protein von Matrix)

  • Oder Veränderung des pH-Werts (Protein verliert Bindungsladung → löst sich ab)

Wenn die Proteine in einem alkalischen Puffer (pH > 7) vorliegen, dann gilt:

• Bei pH-Werten oberhalb des isoelektrischen Punktes (pI) sind Proteine negativ geladen (sie tragen mehr deprotonierte Carboxylgruppen als protonierte Aminogruppen).

• Damit binden sie an eine positiv geladene Matrix → also an einen Anionentauscher.

Grundprinzip:

• Zielgen liegt unter Kontrolle des T7-Promotors (sehr stark, aber nur durch T7-RNA-Polymerase erkannt).

• Die Wirtszelle (E. coli) besitzt von Natur aus keine T7-RNA-Polymerase.

Mechanismus der Dichtigkeit:

• Das Gen für die T7-RNA-Polymerase ist chromosomal in der Wirtszelle integriert (z. B. in BL21(DE3)) und selbst unter Kontrolle eines lacUV5-Promotors.

• Ohne Induktor (z. B. IPTG, Lactose) wird die lacUV5-Promotoraktivität durch den Lac-Repressor (LacI) blockiert → kein T7-Polymerase-Gen-Transkript.

• Folge: Keine T7-Polymerase → keine Transkription vom T7-Promotor → keine (bzw. kaum) Hintergrundexpression.

• Erst nach Zugabe von IPTG/Lactose → Repressor löst sich → T7-Polymerase wird exprimiert → startet Transkription des Zielgens vom T7-Promotor.

• Methan (CH₄) ≈ 50–70 %

• Kohlendioxid (CO₂) ≈ 30–50 % (+ Spuren von H₂S, NH₃, Wasserdampf)

Warum nicht direkt ins Erdgasnetz eingespeist?

• Zu niedriger Methananteil (Erdgas enthält typischerweise > 90 % CH₄).

• Aufbereitung nötig: Entfernung von CO₂, H₂S, Wasser → kostenintensiv.

• Transportprobleme: Einspeisung erfordert Druckanpassung, Gasqualität, Infrastruktur.

• Lokal nutzbar: In Blockheizkraftwerken (BHKW) kann Biogas direkt zur gekoppelten Strom- und Wärmeerzeugung eingesetzt werden (höhere Effizienz, Nutzung der Abwärme).

Die Nettoausbeute beträgt 2 Mol Laktat pro Mol Glukose.

Es ergibt sich eine Reaktionsenthalpie von 467 𝑘𝐽/𝐶−𝑚𝑜𝑙 , also pro Mol Kohlenstoff der C-Quelle Glukose. Es zeigt sich, dass dieser Wert weitestgehend unabhängig von der C-Quelle ist, wenn der Sauerstoffverbrauch der stöchiometrischen Betrachtung berücksichtigt wird mit 𝑌os = 𝑀𝑜𝑙 𝑂2 / 𝑀𝑜𝑙 𝐶 . Im Allgemeinen wird 𝜟𝑯𝒓 = 𝒀os × 𝟒𝟔𝟎 𝒌𝑱/𝑪−𝒎𝒐𝒍 verwendet.

Regler versuchen eine Abweichung der Regelgröße vom Sollwert durch Veränderung der Stellgröße auszugleichen.

Beispiel: Temperatur zu niedrig => Heizleistung erhöhen →Umkehrung des Wirksinnes!

Die einfachsten Regler sind unstetige Regler, die entweder zwei oder mehr distinkte Einstellmöglichkeiten haben

(z.B. an/aus oder aus/mittel/stark). Solche Regler zeigen immer mehr oder weniger starke Oszillationen.

Proteine benötigen für eine optimale Löslichkeit eine gewisse Ionenstärke (Einsalzeffekt). Je nach Salz kann die Löslichkeit mit zunehmender Ionenstärke wieder deutlich sinken (Aussalzeffekt). Die Effekte sind pH-Wert-abhängig.

Zu beachten:

• Das Salz muss wieder entfernt werden

• Zu viel Salz kann zu Konformationsänderungen des Proteins führen (Aktivitätsverlust)

• Selektivität kaum gegeben

• Konservierende Wirkung des Salzes

• Großtechnisch nur mit Rückgewinnung des Salzes wirtschaftlich

Eine Schaumbildung kann für die Extraktion von grenzflächenaktiven Substanzen genutzt werden. Diese adsorbieren an die Schaumbläschen. Hydrophobe Reste ragen dabei in die Gasblase hinein, hydrophile Reste orientieren sich zum Wasser. Der aufsteigende Schaum entwässert zunehmend. Zunächst durch die Schwerkraft bedingt, dann auch durch die sogenannte „Saugwirkung der Plateau-Borders“(b)

Dank hoher Diffusionskoeffizienten und niedriger Viskosität eignen sich superkritische Gase hervorragend für eine Solventextraktion. Im Lebensmittelbereich wird meist CO2 verwendet, da es nicht brennbar, nicht korrosiv und schnell rückstandsfrei verdampfend ist.

Die Auflösung ist ein Maß, wie gut zwei Komponenten voneinander getrennt sind.

Als Auflösung wird das Verhältnis von Selektivität und Effizienz eines Systems bezeichnet. Sie sagt nichts darüber aus, wie breit die Peaks sind.

Unaufgelöste Peaks können getrennt werden durch:

· Vergrößern der Effizienz des Trennsystems

· Vergrößern der Selektivität

Effizienz = Maß fur die Peakverbreiterung einer Komponente

schmale Peaks = effizientes System

Säule mit positiv oder negativ geladenen Enden

Elution normalerweise durch Erhöhung der Ionenstärke in Form eines Salzgradienten

➢ erlaubt die Separation mehrerer/vieler unterschiedlicher Moleküle

➢ praktisch immer eingesetzt in der Phase der Methodenentwicklung

➢ flachere Gradienten erhöhen Auflösung; Nachteil: stärkere Verdünnung

Elution durch pH-Änderung: prinzipiell möglich, wird aber meist nur zur Regeneration des Ionenaustauschers verwendet

a) niedriger pH: Alle Proteine haben positive NettoOberflächenladung

➢ CIEX: alle drei Proteine binden ➢ AIEX: keines der Proteine bindet

b) pH im leicht saueren Bereich: Blau hat negative Netto-Ladung, Grün und Rot haben positive NettoLadung

➢ CIEX: Grün und Rot binden, Blau nicht ➢ AIEX: Blau bindet, Grün und Rot nicht

c) pH im leicht basischen Bereich: Blau und Grün haben negative Netto-Ladung, Rot hat positive Netto-Ladung

➢ CIEX: Rot bindet, Blau und Grün nicht ➢ AIEX: Blau und Grün binden, Rot nicht

d) hoher pH: Alle Proteine haben negative NettoOberflächenladung

➢ CIEX: keines der Proteine bindet ➢ AIEX: alle drei Proteine binden

1. Ausschlussgrenze: kleinste Molekülmasse, die nicht mehr in Poren passt

2. Trennprinzip: große Moleküle eluieren zuerst, kleine später

3. Parameter:

   • Vₑ = Elutionsvolumen

   • Vₑ/V₀ = relatives Elutionsvolumen (säulenunabhängig)

   • Vₜ = Vₓ + V₀ (Gesamtvolumen)

4. Hinweis: Molekülform beeinflusst das Verhalten

1. Tags = kurze Peptid- oder Proteinsequenzen, die an Zielproteine fusioniert werden

2. Dienen zur Reinigung, Stabilisierung, Detektion

3. Meist einfache Strategien → aber sehr effektiv

4. Fortschritt: Entwicklung von Compound-Tags (Kombination mehrerer Funktionen)

1. His-Tag: Bindung an immobilisiertes Ni²⁺/Co²⁺ (IMAC)

2. Strep-Tag: Bindung an Streptavidin/Derivate

3. Nutzen: gezielte und effiziente Reinigung

4. Häufigste Gruppe von Protein-Tags

• Solubilisierungstags (z. B. MBP, GST) → verbessern Faltung & Löslichkeit

• Detektionstags (z. B. FLAG, HA, Myc) → ermöglichen Nachweis in Assays/Western Blot

• Cleavage-Sites (z. B. TEV, Thrombin) → gezieltes Entfernen von Tags nach der Aufarbeitung

1. Mehrdomänige Fusions-Tags, Kombination verschiedener Modalitäten

2. Beispiel: His-Tag + MBP → einfache Reinigung + bessere Löslichkeit

3. Vorteil: optimierte Eigenschaften für unterschiedliche Zielproteine

4. Besonders effektiv bei großen Proteinbibliotheken oder Hochdurchsatzverfahren

1. Trennprinzip:

   • Metallionen (meist Ni²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺) werden an eine Matrix (z. B. Agarose) gebunden

   • Proteine mit Histidin-reichen Sequenzen (z. B. His-Tag) koordinieren über ihre Imidazolgruppen mit den Metallionen

2. Bindung:

   • Koordinationsbindung zw. Histidin-Seitenketten und immobilisierten Metallionen

3. Elution:

   • Zugabe von Imidazol (konkurriert mit His-Resten um Metallbindung)

   • Oder durch pH-Änderung / Chelatoren (z. B. EDTA)

4. Vorteile:

   • Hohe Selektivität für His-Tags

   • Schnelle, einfache Reinigung rekombinanter Proteine

5. Einsatz:

   • Standardmethode für Aufreinigung von His-Tag-Fusionsproteinen

a) FATT-Tag

• Kombination: FLAG-Tag (Detektion) + hyperacidischer Abschnitt (aus APP)

• Zweck: einfache Detektion + spezielle biophysikalische Eigenschaften

b) Multifunktionales His-Tag

• Kombination: His-Tag + zusätzliche Domäne (z. B. für bessere Expression oder quantitative Detektion)

• Besonderheit: His-Tag kann auch genutzt werden, um das abgespaltene Funktions-Domänfragment nach Reinigung zu entfernen

c) Multitag

• Kombination aus: zwei orthogonalen Reinigungstags + Detektionsdomäne + Protease-Erkennungssequenz

• Zweck: hohe Flexibilität → verschiedene Reinigungsstrategien möglich

• Trennung von Proteinen nach Oberflächenhydrophobizität

• Matrix: hydrophobe Liganden (z. B. Butyl, Octyl, Phenyl) gebunden an Trägermaterial

• Hohe Salzkonzentration (z. B. Ammoniumsulfat)

• „Salting-out“-Effekt → verstärkt hydrophobe Wechselwirkungen

• Proteine lagern ihre hydrophoben Bereiche an die Liganden an

• Schrittweise Senkung der Salzkonzentration

• Hydrophobe Wechselwirkungen werden schwächer → Proteine lösen sich

• Optional: Zugabe von milden organischen Lösungsmitteln

• Schonende Reinigung, Proteine bleiben in nativer Faltung

• Feine Trennung ähnlicher Proteine

• Typischer Polierschritt nach Affinitäts- oder Ionenaustauschchromatographie

• Assoziation Protein ↔ hydrophober Ligand erhöht die Gesamtentropie

• Entsteht, weil Wassermoleküle von hydrophoben Oberflächen freigesetzt werden

• Effekt: „Hydrophober Effekt“

• Salze verändern die Polariät des Lösungsmittels

• Lyotrope Ionen = verstärken hydrophobe Interaktion

• Chaotrope Ionen = schwächen hydrophobe Interaktion

• Hofmeister-Serie (Anionen, abnehmend lyotrop): PO₄³⁻ > SO₄²⁻ > CH₃COO⁻ > Cl⁻ > Br⁻ > NO₃⁻ > ClO₄⁻ > I⁻ > SCN⁻

• Kationen-Reihe (abnehmend lyotrop): NH₄⁺ > Rb⁺ > K⁺ > Na⁺ > Cs⁺ > Li⁺ > Mg²⁺ > Ca²⁺ > Ba²⁺

• Ammoniumsulfat ((NH₄)₂SO₄) → sehr starker Lyotrop, fördert Bindung

• Natriumchlorid (NaCl) → milder Effekt, ebenfalls häufig eingesetzt

• Verringern die hydrophoben Wechselwirkungen

• Beispiele: Glycole, Acetonitril, Alkohole

• Anwendung: zur Elution stark gebundener Proteine

• Mechanismus: Veränderung der Lösungsmittelpolarität

• Stationäre Phase: polar (z. B. Kieselgel, Al₂O₃)

• Mobile Phase: unpolar (z. B. Hexan, Chloroform, Dichlormethan)

• Elution:

  • Polare Analyten binden stärker an der stationären Phase → eluieren später

  • Unpolare Analyten eluieren zuerst

• Gradienten-Elution: steigende Polarität des Lösungsmittels → löst polare Moleküle von der Matrix

• Stationäre Phase: unpolar (z. B. C18-Silica, C8)

• Mobile Phase: polar (z. B. Wasser + Methanol/Acetonitril)

• Elution:

  • Unpolare Analyten binden stärker → eluieren später

  • Polare Analyten eluieren schneller (kaum Retention)

• Gradienten-Elution: steigender Anteil organisches Lösungsmittel (z. B. Methanol, Acetonitril) → eluieren zunehmend unpolare Moleküle

• Normalphase: Polarität der stationären Phase ist hoch → polare Moleküle bleiben länger zurück

• Umkehrphase: Polarität der mobilen Phase ist hoch → unpolare Moleküle bleiben länger zurück

• Faustregel:

  • Normalphase: „Unpolar zuerst“

  • RP: „Polar zuerst“

• Extrachromosomale DNA

• Meist doppelsträngig

• Meist zirkulär

• Notation: kleines „p“ vor dem Namen (z. B. pUC19)

• Replikationsursprung (Ori) → Replikation unabhängig vom Chromosom

• Systeme zum Erhalt in der Zelle (Partitionierung, Segregation)

• In der Natur: können Toxine kodieren

• In Biotechnologie: meist Antibiotikaresistenzmarker

• „High copy“-Vektor

• Grund: Mutation im Ori → führt zu hoher Kopienzahl pro Zelle

RNA II dient als Primer für die DNA-Replikation, muss aber vorher durch RNase H prozessiert werden.

„oriV“ markiert den Übergangspunkt zwischen RNA-Primer (RNA II) und DNA bei der Initiation der Replikation.

RNA I bindet an RNA II und verhindert deren Prozessierung durch RNase H, wodurch die Replikation und damit die Kopienzahl reguliert wird.

N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure sind hierbei β(1→4) glycosidisch miteinander verknüpft.

An N-Acetylmuraminsäure ist eine Kette aus vier Aminosäuren angeknüpft.

Der Operator ist eine DNA-Sequenz, an die der Repressor bindet. Dadurch blockiert er die RNA-Polymerase und verhindert die Transkription der lac-Gene. Bindet jedoch Allolactose an den Repressor, löst er sich vom Operator und die Transkription wird aktiviert.

Das Lactose-Operon wird nur angeschaltet, wenn Glucose fehlt und Lactose vorhanden ist.

Fehlt Glucose, bindet CRP am Promotor und erleichtert die RNA-Polymerase-Bindung.

Ist Lactose vorhanden, löst sich der LacI-Repressor vom Operator, sodass die Transkription erfolgen kann.

In pET-Plasmiden liegen Zielgene unter Kontrolle starker T7-Promotoren. Die Expression startet, sobald T7-RNA-Polymerase im Wirt bereitgestellt wird. Da das Enzym sehr selektiv und aktiv ist, kann das Zielprotein nach Induktion >50 % des Gesamtproteins ausmachen. Die Expression lässt sich über die Induktor-Konzentration regulieren und bleibt ohne T7-RNA-Polymerase transkriptionell still. Die Bereitstellung der Polymerase erfolgt durch Infektion mit Phage λCE6 oder durch Wirte mit chromosomaler T7-RNA-Polymerase unter lacUV5-Kontrolle.

1. Herstellung des Insters

2. Herstellung des offenen Vektors

3. Zusammenfügen

4. In Zellen einbringen

5. Vermehren

Plasmide dienen als Vektoren zur gezielten Übertragung und Expression von Genen. Sie sind Grundlage für die Herstellung vieler biotechnologischer Produkte wie rekombinanter Proteine, Enzyme, Impfstoffe und therapeutischer Wirkstoffe.

Covalently closed circular (CCC) Plasmide sind supercoiled und laufen schneller als nicked/relaxed Kreise. Ein Bruch in einem Strang entspannt das Plasmid, macht es weniger kompakt und verlangsamt die Migration. Lineare DNA kann je nach Bedingungen ähnlich wie nicked Kreise laufen.

Intravenöse Glucose-Injektion führt zu geringerer Insulin-Ausschüttung als orale Gabe. Glucagon-like Peptid 1 (GLP-1) wird von der Darmschleimhaut nach Glucoseaufnahme gebildet und stimuliert die Insulinausschüttung

Zur Herstellung wird das Gen für GLP-1 in ein Plasmid kloniert und in einen geeigneten Wirt (z. B. E. coli oder Hefen) eingebracht. Dort erfolgt die rekombinante Expression des Peptids. Anschließend wird das Protein gereinigt und chemisch modifiziert – u. a. durch Anfügen einer Fettsäure-Seitenkette, die die Bindung an Albumin verstärkt und die Halbwertszeit verlängert. So entsteht ein stabiles, therapeutisch nutzbares GLP-1-Analogon

Beim Capping wird ein methyliertes Guanin über eine ungewöhnliche 5’-5’-Triphosphatbindung an das 5’-Ende der RNA angehängt.

• Schritt 1: RNA-Triphosphatase entfernt die γ-Phosphatgruppe.

• Schritt 2: Guanylyltransferase fügt GMP an die β-Phosphatgruppe der RNA an (über ein Enzym–GMP-Zwischenprodukt).

• Schritt 3: Methyltransferasen methylieren das neue Guanin und oft auch den ersten Basenrest der mRNA. Die 5’-Cap-Struktur schützt die mRNA vor Abbau und dient als Signal für die Ribosomen-Rekrutierung bei der Translation.

Nach der Transkription des Poly-A-Signals (5’-AAUAAA-3’) werden die Enzyme CPSF und CSTF vom CTD der RNA-Pol II auf die RNA übertragen. Es folgen:

1. Spaltung der prä-mRNA an einer CA-Stelle downstream des Signals

2. Anfügen von ca. 250 Adeninresten durch die Poly(A)-Polymerase

3. Abbau des restlichen RNA-Strangs durch eine 5’→3’-Ribonuklease

4. Termination der Transkription Meist liegt zusätzlich eine GU-reiche Sequenz weiter stromabwärts. Die Poly(A)-Schwanz schützt die mRNA und fördert Export und Translation.

Für das Entfernen von Introns sind drei Sequenzelemente entscheidend:

• 5’-Splice-Site (Donor): fast immer GU am Intronanfang, in größerem konservierten Kontext

• Branchpoint: enthält ein Adenin, liegt 20–50 Nukleotide vor dem 3’-Ende

• 3’-Splice-Site (Akzeptor): fast immer AG am Intronende, davor ein polypyrimidinreicher Abschnitt (C/U-Trakt) Diese Konsensussequenzen werden vom Spleißosom erkannt und ermöglichen präzises Herausschneiden der Introns.

Die von Marilyn Kozak beschriebene Konsensus-Sequenz (G/ANNATGG) in der 5’-UTR ist wichtig für eine effiziente Initiation der Translation bei Wirbeltieren. Punktmutationen um das Startcodon beeinflussen die Effizienz stark. Besonders entscheidend ist ein Purin (A/G) an Position -3: wird es durch ein Pyrimidin ersetzt, sinkt die Proteinsynthese um bis zu 95 %.

• N-Glykosylierung: Anheftung von Zuckerketten an die Aminogruppe von Asparagin (Asn) in der Sequenz Asn-X-Ser/Thr. Erfolgt co-translational im Endoplasmatischen Retikulum.

• O-Glykosylierung: Anheftung von Zuckerketten an die Hydroxylgruppe von Serin oder Threonin. Erfolgt meist posttranslational im Golgi-Apparat.

Beide Modifikationen beeinflussen Faltung, Stabilität und Funktion von Proteinen.

• Endotoxin-freies Produkt (Lipopolysaccharid (LPS)-Endotoxine aus den Zellwänden Gram-negativer Bakterien)

• Hohe Sequenzgenauigkeit (gegenüber Festphasensynthese)

• Sekretion des (Pre-)Peptids (vereinfacht Aufarbeitung)

• Faltung im Endoplasmatischen Retikulum

• Hohe Ausbeute, einfache Skalierung

• Vgl. mit SPPS besserer ökologischer Fußabdruck

• Regulatorische Aspekte (bekannte Plattformtechnologie)

• (Humanähnliche Glykosylierung)

Die ABE-Gärung ist ein anaerober Stoffwechselweg von Clostridien. Dabei werden Zucker zunächst zu Säuren (Essigsäure, Buttersäure) abgebaut. Anschließend schaltet der Stoffwechsel auf die Lösungsmittelbildung um, wobei hauptsächlich Butanol, Aceton und Ethanol entstehen (ca. 6:3:1 Verhältnis). Dieser Prozess wurde industriell zur Lösungsmittelproduktion genutzt.

Der ED-Weg ist ein alternativer Zuckerabbaustoffwechsel in Bakterien, der Glukose oder andere Zucker zu Pyruvat und Glycerinaldehyd-3-phosphat abbaut. Er ersetzt teilweise die Glykolyse, besonders in Organismen, die keine Phosphofructokinase besitzen. Der Weg liefert Energie und Ausgangsverbindungen für Fermentation oder andere Stoffwechselprozesse.

• Viele Bakterien besitzen keine Phosphofructokinase-1 und können daher die klassische Glykolyse nicht nutzen.

• Der ED-Weg erlaubt die Verwertung von Gluconat und anderen organischen Säuren.

• Beispiel: E. coli nutzt sowohl Glykolyse als auch ED-Weg, Zymomonas mobilis ausschließlich den ED-Weg (Fermentation von Agavensaft).

• Die Gärung über den ED-Weg verläuft 3–4× schneller als über die Glykolyse; Z. mobilis erreicht eine höhere Ethanol-Ausbeute als Hefe.

• Dennoch wird technisches Ethanol meist mit Saccharomyces cerevisiae produziert (geringere Substratansprüche).

• Produziert ausschließlich das L-Enantiomer der Aminosäuren

• Nutzt nachwachsende Rohstoffe

• Umweltschonender Prozess

• Wichtige Stämme:

  • Corynebacterium glutamicum: Temp.-Optimum 30 °C, phagenresistent

  • Escherichia coli: Temp.-Optimum 37 °C

Wildtyp-Stämme produzieren nur so viel Aminosäure, wie sie für ihr eigenes Wachstum benötigen (Regulation durch Operons, Produktinhibition etc.). Durch gezielte Stammentwicklung (rationales Engineering) kann die Produktausbeute deutlich gesteigert werden.

• Substrat: α-Ketoglutarat

• Vermehrte Bildung: bei Störung der Zellwand (nichtphosphoryliertes OdhI hemmt ODH)

• Ausschleusung: über Transporter YggB

• Induktion: z. B. durch Detergenzien oder Hitzeschock

• Ausbeute: ca. 60–70 % der eingesetzten Glukose

Die Biogasproduktion erfolgt anaerob in mehreren Stufen:

1. Hydrolyse: Makromoleküle (Kohlenhydrate, Proteine, Lipide) werden zu Zucker, Aminosäuren und Fettsäuren gespalten.

2. Acidogenese: Fermentative Bakterien wandeln diese Produkte in kurzkettige organische Säuren, Alkohole, H₂ und CO₂ um.

3. Acetogenese: Organische Säuren und Alkohole werden zu Essigsäure, H₂ und CO₂ abgebaut.

4. Methanogenese: Methanogene Archaeen wandeln Essigsäure, H₂ und CO₂ in CH₄ (Methan) und CO₂ um.

• Endprodukt: Biogas (CH₄ + CO₂), nutzbar als erneuerbarer Energieträger

1. Mechanische Reinigungsstufe:

   • Grob- und Feinrechen, Sand- und Fettfang

   • Entfernt Feststoffe und grobe Verunreinigungen

2. Biologische Reinigungsstufe:

   • Belebtschlammverfahren oder Tropfkörper

   • Mikroorganismen bauen organische Stoffe ab (z. B. Kohlenstoff, Stickstoff)

3. Chemische/physikalische Nachbehandlung:

   • Flockung, Sedimentation, Desinfektion

   • Entfernung von Phosphaten, Spurenstoffen und Pathogenen

1. Ammonifikation: Abbau organischer Stickstoffverbindungen zu Ammonium (bereits im Zulaufkanal).

2. Nitrifikation (aerob):

   • Ammonium → Nitrit: durch Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosovibrio

   • Nitrit → Nitrat: durch Nitrobacter, Nitrococcus, Nitrospina, Nitrospira

3. Denitrifikation (anaerob):durch Oxidation von Acetat