Qualitative und quantitative Bestimmung sekundärer Pflanzenstoffe in Lebensmitteln

Syntheseprodukte von Pflanzen, die nicht dem primären Stoffwechsel (Kohlenhydrate, Fett, Proteine), sondern dem sekundären zuzuordnen sind

• wirken dosisabhängig

• von gesundheitsfördernd hin zu gesundheitsschädigend

• Farbstoff

• Wachstumsregulatoren

• Abwehr von Fressfeinden

• Schutz vor Stressoren, wie UV-Strahlung oder Pathogenen

• keine Essentialität

• keine Zufuhrempfehlungen

• Bindung von Mineralstoffen (z.B. Calcium, Eisen oder Zink)

• Hemmen von Verdauungsenzymen (z.B. Amylase, Proteasen)

-> erst bei einem sehr hohen Konsum oder bei einer hohen Einnahme isolierter Sekundärer Pflanzenstoffe (z.B. durch Supplements)

-> unerwünschte Auswirkungen ernährungsphysiologisch ohne Relevanz

ca. 1,5 g pro Tag (> 10.000 Einzelsubstanzen)

• Antioxidative Effekte

• Regulation von Zellwachstum und -differenzierung

• Signaltransduktion

• Biotransformation

• antimikrobielle Aktivität

-> schwieriges Klassifikationssystem aufgrund der Heterogenität

-> Folgende übliche Einteilung: chemische als auch funktionale Aspekte (aus chemischer Sicht ist diese Einteilung jedoch nicht strikt)

• Carotinoide

• Polyphenole

• Phytoestrogene

• Phytosterole

• Glucosinolate

• Sapoine

• Monoterpene

• Sulfide

• Proteaseinhibitoren

• Phytate

• Vorkommen: rote, gelbe, grüne Gemüse- und Obstarten

• Bioverfügbarkeit: > 15% (erhitzte Lebensmittel) und < 3% (unerhitzte Lebensmittel)

• Durchschnittliche Zufuhr: 5-6 mg pro Tag

• Vorkommen: Gemüse, Obst (besonders Randschichten), Vollkorngetreide, Tee, Kakao

• Bioverfügbarkeit: Anthocyane und Flavone < 3% und übrige Flavonoide > 15%

• Durchschnittliche Zufuhr: Flavonoide 50-100 mg pro Tag und Phenolsäure 200-300 mg pro Tag

• Vorkommen: Sojabohne, Leinsamen, Vollkorngetreide

• Bioverfügbarkeit: > 15%

• durchschnittliche Zufuhr: < 5 mg pro Tag (ggf. höher z.B. bei soja-reicher Nahrung)

• Vorkommen: Samen und Nüsse + daraus hergestellte Öle

• Bioverfügbarkeit: 3-5%

• durchschnittliche Zufuhr: 170-440 mg pro Tag

• Vorkommen: Kohlgemüse, Rettich

• Bioverfügbarkeit: > 15%

• durchschnittliche Zufuhr: < 50 mg pro Tag

• Vorkommen: Hülsenfrüchte, unreife Tomaten

• Bioverfügbarkeit: < 3%

• durchschnittliche Zufuhr: < 15 mg pro Tag

• Vorkommen: Zitrusfrüchte, Gewürzpflanzen

• Bioverfügbarkeit: > 15%

• durchschnittliche Zufuhr: nicht bekannt

• Vorkommen: Lauch- und Zwiebelgewächse

• Bioverfügbarkeit: > 15%

• durchschnittliche Zufuhr: nicht bekannt

• Vorkommen: Hülsenfrüchte, Vollkornerzeugnisse, Nüsse

• Bioverfügbarkeit: 3-10%

• durchschnittliche Zufuhr: 300 mg pro Tag

• Vorkommen: Hülsenfrüchte, Vollkornerzeuugnisse

• Bioverfügbarkeit: < 3%

• durchschnittliche Zufuhr: nicht bekannt

• wasserlöslich

• gelb gefärbt (mit Ausnahme der Anthocyane -> blau, pH-abhängig)

• generell in glykolyierter Form

• Mono-, Di- sowie Trisaccharide

• beta-glykosidisch gebunden

• Unterteilung in sechs Verbindungsklassen ( je nach Lokalisation des B-Ringes und der Substituenten am Pyranring (C-Ring))

• es liegen auch unkonjugierte Verbindungen wie Daidzein und Genistein vor, jedoch nur in geringer Konzentration

• Flavonoidstruktur kann zusätzlich noch weiter durch Methyl- und Hydroxylgruppen modifiziert bzw. sulfatiert werden

• Flavone

• Flavanone

• Flavonole

• Flavanole

• Anthocyanidine

• Isoflavone

Flavone

Flavanone

Flavonole

Flavanole

Anthocyanidine

Isoflavone

• Apigenin

• Luteolin

• Hesperetin

• Naringenin

• Quercetin

• Morin

• Catechin

• Epicatechin

• Genistein

• Daidzein

• Cyanidin

• Delphindin

• dienen der Pflanze als Farb-, Geschmacks- oder Gerbstoffe

• zu ihnwn zählen mehrere Tausend bekannte Verbindungen (> 7000), die auf der chemischen Struktur des Phenols basieren

• sie lassen sich in Flavonoide, Phenolsäuren und Phytoestrogene unterteilen

Phenol

• Polyphenole gehören zu den wertgebenden Bestandteilen im Fruchtsaft

• Diverse kolorimetrische Methoden möglich

• zu berücksichtigen sind: andere reduzierende Verbindungen, wie Ascorbinsäure oder reduzierende Zucker werden miterfasst

• mit der Fast Blue BB Methode (FBBB) wird spezifisch der Gesamtpolyphenolgehalt ermittelt

Das Fast Blue BB-Salz geht eine Verbindung mit phenolischen Substanzen ein, welche anschließend photometrisch gemessen wird

Das Reaktionsprodukt wird nach 60 Minuten photometrisch bei 420 nm gemessen und im Verhältnis zum Standard (hier Gallussäure, Gallussäureequivalent (GAE)) gesetzt

Azobindung: Diazonium-Gruppe (–+N≡N) bindet an einem aromatischen Ring mit reaktiven Hydroxlgruppen (-OH)

• keine/kaum Interferenzen mit anderen Stoffen wie Ascorbinsäure oder reduzierenden Zuckern

• die Verbindung ist zur Aktivierungsgruppe in der para-Position; sofern diese belegt ist, ist die Substitution an der ortho-Position

• Reaktion findet im leicht alkalischen Milieu statt -> Phenole liegen in einer reaktiven Form (Phenoxid-Ionen) vor

1. Saftproben verdünnen

2. Gallussäure-Standardreihe erstellen

3. Proben/Standards mit der FBBB-Lösung (0,1 %) vermischen

4. Inkubation im Dunklen: 60 Minuten warten

5. Photometrische Messung bei 420 nm

6. Gehalt via Standardreihe (Eichkurve berechnen)

1. Para

2. Meta

3. Ortho

10 ml

Stammlösung (mg/L) / GAE (mg/L)

Volumen total (μl) / Verdünnungsfaktor

Volumentotal (μl) - Volumen Stammlösung (μl)

• färben sich intensiv organe

• im Rhizom von Kurkuma (3-5 %)

• Curcumin, Desmethoxycurcumin, Bisdesmethoxycurcurmin

intensive orange-gelbe Farbe und ein bestimmter Geschmack (z.B. in Curry-Pulver)

• mit potentiell gesundheitsfördernden Auswirkungen

• praktisch unlöslich in Wasser, löslich in Ethanol und Eisessig

• in wässrigen Puffern und physiologischen angepassten pH-Werten (pH 7,2) zerfällt Curcumin schnell in diverse Produkte -> z.B. Ferulasäure, Feruloylmethan, Vanillin

Curcuminoide

• mit der, in Relation zu Wasser eher unpolaren, Ethanol-Extraktation wird das Extrakt mittels Dünnschicht-Chromatographie aufgetrennt und visuell bewertet

1. Pulver (1 Löffel) und Flüssigkeit (5 mL) in den Faltenfilter geben

2. 20 mL Ethanol (99%, vergällt) in den Filter geben und den herausfließenden Extrakt mit einem Becherglas auffangen

3. Extrakt im Heizblock eindampfen (90°C, ca. 15 min)

4. mit einer Kapillare (1 Mikroliter) etwas Probe aufnehmen und auf die vorbereitete Dünnschichtplatte tüpfeln

5. die fertige Platten in die DC-Kammer geben und sobald das Laufmittel kurz vor dem Ende der Platte ist entnehmen

• bis zur markierten Füllhöhe füllen mit dem Eluenten

• Filterpapier hinzugeben -> dies dient dazu, dass die Kammer nach kurzer Zeit möglichst gesättigt ist und die Auftrennung gut ablaufen kann

• Schablone auf die Kammer legen, sodass der untere Rand mit der Schablone übereinstimmt

• eine feine Linie an der Schablone entlang zeichnen und die Stellen für die Proben markieren

• sobald das Laufmittel fast das Ende der DC-Platte erreicht hat, diese aus dem Becherglas entnehmen und die die Linie makieren (Laufmittelfront)

• die Auswertung erfolgt über das visuelle Licht

• Trocknen lassen und Substanzflecken vergleichen, Rf-Wert berechnen

= “Farbenschreiben” = Stoffauftrennung

• verschiedene physikalische Methoden zur Stofftrennung

• Meist alle nahezu identischer Aufbau

• zwei Phasen: eine mobile Phase (flüssig oder gasförmig) und eine stationäre Phase (meist Feststoff)

• in der mobilen Phase gelöste Substanzen interagieren stark oder schwach mit der stationären Phase (gleich Geschwindigkeitsunterschied)

• Die Trennwirkung wird dadurch erzeugt, dass stark oder schwach in der mobilen Phase gelöste Substanzen (Analyten) mit der mobilen Phase in Wechselwirkung treten und beim Durchströmen zurückgehalten (= retendiert) werden

• Stationäre Phase

• Mobile Phase

• Trennprozess

• dünne Schicht (< 200 μm)

• Trägerplatte: einer Aluminium-, Plastik- oder Glasplatte -> sehr kleinen (< 10 μm), gleich großen und gleichmäßig geformten Teilchen

• Trennschicht: Kieselgel (SiO2), Aluminiumoxid, Polyamid oder Cellulose

• DC-Platte wird in die mobile Phase gestellt (DC-Kammer)

• Wirken von Kapillarkräfte

• Probengemisch wird entsprechend der Löslichkeitsprodukte mitgezogen

• beim Trennprozess sind die Verteilungsgleichgewichte entscheidend -> die Einzelkomponenten in der mobilen Phase werden unterschiedlich schnel transportiert

• sobald das Laufmittel das obere Ende der Platte erreicht hat, wird der Vorgang unterbrochen und die Lösungsmittelfront mit einer feinen Linie markiert

• in der Regel qualitativ und substanzspezifisch

• eine quantitative Bestimmung möglich, jedoch aufwendig

• im Visuellen oder UV-Bereich, Fluoreszenz oder über Derivatisierung

• erfolgt mittels Rf-Wert

• Rf-Wert: Retentionsfaktor, Verhältnis zwischen der Laufstrecke des jeweiligen Analyten und der Lösungsmittelfront

Sx / Sf

Sx: Sreecke zwischen Startlinie und Substanzzone

Sf: Strecke zwischen Startlinie und Fließmittelfront

Rf-Wert ist dimensionslos und stoffspezifisch bei gleichem experimentellen Aufbau

• Verteilung eines Stoffes zwischen zwei Phasen (Nernst-Verteilung)

• Adsorption an der Oberfläche von Feststoffen

• Weitere Mechanismen inder Flüssigkeitschromatographie: die Ionenaustausch-, Ausschluss- und Affinitätschromatographie

• Verteilung eines Stoffes zwischen zwei Phasen

• werden zwei Flüssigkeiten, die nicht oder nur begrenzt miteinander mischbar sind, zusammengeschüttet, bilden sich im Gefäß entsprechend zwei Schichten

• wird nun ein Stoff, der sich in beiden Flüssigkeiten lösen kann, hinzugegeben, stellt sich nah einiger Zeit ein Gleichgewicht ein

• Hier: mobile und stationäre Phase

Das Verhältnis der Konzentrationen des gelösten Stoffes in den beiden Flüssigkeiten ist konstant

K = c1 /c2

K-Wert = Verteilungskoeffizient

-> hier K nur von der Temperatur abhängig, nicht aber von den Konzentrationen

c1 und c2 = sind die Konzentrationen der gelösten Substanz in den jeweiligen Flüssigkeiten

• der Analyt (als Neutralverbindung oder auch Ion) wird eine gewisse Zeit lang an die Oberfläche der stationären Phase adsorbiert

• durch relativ schwache physikalische Wechselwirkungen (Van-der-Waals-Kräfte)

• weiterhin strömt kontinuierlich Lösemittel (mobile Phase) nach, sodass er letztendlich desorbiert wird

• hierfür ist besonders wichtig, dass sich die mobile und stationäre Phase in ihrer Polarität unterscheiden

  • eine unpolare mobile Phase mit einer polaren stationären Phase

  • oder eine polare mobile Phase mit einer unpolaren stationären Phase

an die Oberfläche des Säulenmaterials

in das Innere eines Feststoffes

dann liegt die Substanz in hoher Konzentration in einer der beiden flüssigen Phasen vor

stellt sich für jede Substanz unabhängig voneinander jeweils ein Verteilungsgleichgewicht ein

-> diese Verteilungsgleichgewichte bzw. unterschiedliche Verteilungskoeffizienten sind für die Trennung einzelner Stoffe aus Gemischen essentiell

• logarithmierte KL-Wert

• Löslichkeitsprodukt

• ist dieser Wert für eine Substanz sehr klein = sie ist nur schlecht in Wasser löslich (heißt aber nicht unlöslich) -> wenn ein schwerlösliches Salz in Wasser vermengt und filtriert wird, wird im Filtrat trotzdem zumindest eine geringe Menge der Ionen des bestreffenden Salzes nachgewiesen werden können

• die mobile Phase strömt an der stationären Phase vorbei (diese sind nicht miteinander mischbar)

• das Substanzgemisch verteilt sich aufgrund der unterschiedlichen Wechselwirkungen (entsprechend ihrer Löslichkeitsprodukte) in den beiden Phasen

• je nach Stärke der Wechselwirkungen werden die Substanzen unterschiedlich schnell weitergetragen und trennen sich auf

Um die getrennten Substanzen zu detektieren, kann eine Bandbreite an verschiedenen Deketoren genutzt und bei bestimmte Chromatographieverfahren auch teilweise in Reihe geschaltet werden

• UV/VIS-Dekektor: Absorption von Strahlung

• Diodenarray-Detektor: Wie UV/VIS, jedoch viele Wellenlängen gleichzeitig

• Fluoreszenz-Detektor: Emission von Strahlung -> Fluoreszenz

• Refraktormetrischer Detektor: Brechung des Lichts

• Elektrochemischer Detektor: Redoxpotenziale

• Massenspektrometrischer Detektor: Molekülmasse

• nicht alle Analyten lassen sich in ihrer ursprünglichen Form detektieren

• ist dies der Fall, kann an den Analyten synthetisch eine funktionelle Gruppe gebunden werden

• durch diese Modifikation kann anschließend der Analyt mit einem geeigneten Detektor gemessen werden

• bei der Stoffaufreinigung werden z.B. freie Carbonsäuren (-COOH) verestert, um eine Substanz leichter von der stationären Phase lösen zu können -> die Wechselwirkungen werden geschwächt

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