Nachweis gentechnischer Veränderung in Lebensmitteln

Gentechnisch veränderter Organismus -> Einbau von fremden genetischen Materials in einen Organismus

genetically modified organism

Polymerase chain reaction = Polyermase-Kettenreaktion

• Proteine übernehmen (lebens-)wichtige Funktionen im Körper (z.B. Enzyme, Hormone, Stofftransport, Signaltransduktion)

  • Insulin, Rezeptoren, Hämoglobin, Transkriptionsfaktoren

• Proteine sind das “End-Produkt” der Genexpression

• beinhaltet die Vorgänge Transkription und Translation

  
  

• in den Genen (DNA) steht geschrieben, welche Aminosäuresequenz das Protein hat

• die Aminosäuresequenz wiederum legt die Struktur eines Proteins fest

• die Nukleotidsequenz eines Gens wird abgeschrieben

• die Abschrift bezeichnet man als mRNA

• Die Abschrift (mRNA) wird als Vorlage für die Bildung eines Proteins benutzt

• Basentripletts werden hierbei in Aminosäuren übersetzt, die aneinander gereiht das Protein ergeben

hier befinden sich die Basentripletts, die für das Protein kodieren

• bestehen wie das gesamte Gen aus DNA und damit Basentripletts, kodieren aber nicht für das Protein

• werden vor der Translation aus der mRNA rausgeschnitten (Splicen)

• eine Region vor dem Gen (= upstream des Gens)

• diese Region wird nicht transkribiert, also nicht zu mRNA abgeschrieben

• hier binden Transkriptionsfaktoren dran, die die Transkription und damit Expression des Gens kontrollieren

• Transkriptionsfaktoren sorgen dafür, dass das Enzym, welches die DNA abschreibt (= Polymerase), an die DNA binden kann

hier endet die Transkription, Stop-Signal

• 355 Promotor aus dem Cauliflower Mosaic Virus (CaMV355)

• die bereits in der Natur dazu, die Transkription in allen Pflanzenzellen zu induzieren

• Nopaline-Synthase (T-nos)

• stammt aus dem Agrobacterium tumfaciens

Je 3 Basentripletts codieren für die Aminosäuren

Uracil statt Thymin bei RNA

• Diagnose von Virusinfektionen/Erbkrankheiten

• Forschung

• Forensik

• Klonen/Gentechnik

• Vermehrung von DNA in-vitro

• Exponenziell große Menge eines DNA-Abschnitts aus einer Probe (Template)

• Template und Mastermix

• enthält isolierte DNA

• Vorlage

• um eine PCR-Amplifikation durchzuführen, braucht man mindestens einen DNA-Template-Strang

• enthält alle notwendigen Reagenzien

• Herstellung von zwei Mastermixen (für Pflanzen-Primer und GVO-Primer)

1. Puffer

2. Taq-Polymerase

3. dNTPs (Desoxyribonukleosidtriphosphate)

4. Primerpaar

• Es wird nicht irgendein DNA-Abschnitt repliziert

• Zielgen wird ausgesucht

• Primer designen die einen bestimmten Abschnitt dieses Gens makieren, der von der Polymerase repliziert werden soll (definierte Größe)

• Oligonukleotide (ca. 20 Basenpaare, dienen als “Starthilfe für die Polymerase)

• Zwei Primerpaare dienen zum Nachweis zweier DNA-Abschnitte (forward und reverse)

• mittels eines Primerpaars bestimmt man welcher Teil des DNA-Templates vervielfältig wird

5’-3’-Richtung

5’-3’-Richtung

1. Lebensmittelprobe (z.B. Maismehl aus dem Asialaden)

2. Negativ-Kontrolle (z.B. zertifizierte non-GMO Haferflocken)

3. Positiv-Kontrolle (gelöste DNA-Sequenzen in Wasser, die CamV35S, T-NOS und das Pflanzengen enthalten)

4. No template control (NTC)

1. Denaturierung (94-96°C, 1-9 min)

2. Annealing der Primer (55-65°C)

3. Extension des DNA-Abschnitts (72-80°C)

-> im Thermocycler, ca. 40 Zyklen

bei der thermischen Denaturierung wird die DNA der zu untersuchenden Probe in einzelsträngige DNA überführt

An die Einzelstränge hybridisieren die Oligonukleotid-Primer

Im letzten Schritt der PCR erfolgt die Synthese der komplementären Stränge durch die DNA-Polymerase

no template control (NTC)

• Wasser zum Mastermix -> die NTC-Ansätze dürfen also kein PCR-Reaktionsprodukt zeigen

• muss thermisch stabil sein, da die PCR zwischen 55°C und 100°C stattfindet

• sie wird aus einem thermophilen Bakterium (Thermus aquaticus) isoliert, welches hohe Umgebungstemperaturen präferiert (Taq Polymerase)

• durch Gelelektrophorese

• Herstellung eines Agarosegels

• Auftragen der Proben

• Elektrophorese (100V, 30 min)

• Auswertung unter UV-Licht

  
  

• durch Anlegen einer Spannung werden die PCR-Produkte nach ihrer Größe aufgetrennt

• aufgrund der Phosphatreste ist die DNA negativ geladen und wandert durch die Poren im Gel

• kleine Fragmente wandern schneller als große

• das Gel wird mit z.B. Ethidiumbromid oder Midori Green angefärbt, so dass unter UV-Licht die Banden sichtbar und ausgewertet werden können

1. Pestresistenz (z.B. “delta-endotoxin” gegen Maiszünsler)

2. Herbizidtoleranz (z.B. 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphate-Synthase gegen Glyphosat)

3. Verzögerung der Fruchtreifung (z.B. Flavr-Savr-Tomate)

4. Optimierung der Nährwerte (z.B. Golden Rice)

• Rote Gentechnik (Medizin, Pharmazie) - z.B. Herstellung von Humaninsulin

• Weiße/graue Gentechnik (Industrie) - z.B. Herstellung von Waschmittelenzymen

• Grüne Gentechnik (Landwirtschaft) - z.B. Futtermais, Golden Rice

• umweltfreundlicher Anbau (verringerter Herbizid-/Pestizideinsatz)

• Reduzierte Bodenbeanspruchung (Bewahrung von Ackerland)

• Verbesserte Nährstoffversorgung ( Malnutrition, Welthunger)

• Nutzung von zuvor unbrauchbaren Ackerflächen

• Kreuzkontamination mit natürlichen Getreidesorten

• Erzeugung pestizidresistenter “Superschädlinge”

• Potentiell allergenes Risiko neuartiger Proteine

• Selektionsmarker-induzierte Antibiotikaresistenz

• Gesundheitliche Beeinträchtigung (Diskussion miRNA)?

• Mangelnde Forschung bezüglich Beeinträchtigung der Pflanzenvielfalt u.a. Umweltfaktoren

• In der EU müssen Lebensmittel, die gentechnisch veränderte Organismen (GVO) enthalten oder daraus hergestellt wurden, gekennzeichnet werden, auch wenn im Endprodukt keine GVO nachweisbar sind

• Dies geschieht durch den Zusatz „genetisch verändert“ oder „aus genetisch verändertem... hergestellt“ in der Zutatenliste oder als Fußnote

• Eine Ausnahme besteht für versehentliche oder technisch unvermeidbare Spuren von zugelassenen GVO unter 0,9 Prozent

• Nicht gekennzeichnet werden müssen Produkte, die von Tieren stammen, die mit GVO-Futtermitteln gefüttert wurden, oder bei Verwendung von Hilfsstoffen (z.B. Enzyme), die mit GVO hergestellt wurden, aber nicht im Lebensmittel verbleiben

1. Protein finden, welches die Eigenschaften einer Kulturpflanze verbessern kann

2. Für das Protein codierendes Gen lokalisieren und isolieren

3. Gen so verändern, dass es auch in den Zellen der Kulturpflanze korrekt abgelesen werden und das relevante Protein in der Zelle synthetisiert werden kann: durch Rationalisierung = Entfernung der Introns und Hinzufügen und Verändern von Sequenzen

4. Transfektion

5. Rückkreuzung

• Einbringen Fremd-DNA in eine Zelle

• Transfektion einzelner Zellen, aus denen dann neue Pflanzen wachsen, die in jeder Zelle ds gewünschte Gen enthalten und damit das Protein exprimieren

• klappt nucht bei der ganzen Pflanzen

nicht sonderlich effektiv

1. Agrobacterium tumefaciens (die Bakterium ruft eine Krankheit in der Pflanzen hervor, indem es seine eigene DNA in das Genom der Wirtszelle injiziert)

2. Elektroporation

3. “Gene Gun” (Gold Partikel, die mit der zu transfizierenden DNA beladen sind, werden in die Zelle geschossen)

4. Mikroinjektion (DNA kann direkt in verankerte Zellen injiziert werden)

mittels gleichzeitig transfizierter Selektionsmarker z.B. Antibiotikaresistenzen oder Green Fluorescent Protein (GFP) überprüft man, ob die Transfektion erfolgreich war

Rückkreuzung der genetisch modifizierten Kulturpflanze in die konventionelle Kulturpflanzenart, die auf den Feldern angebaut wird

• ELISA (enzyme linked immunsorbent assay)

• PCR

• Identifiziert Proteine

• Test basiert auf Antikörper, die das spezifische Protein identifizieren

• kann nur frische Produkte untersuchen (keine hochprozessierten Lebensmittel)

• Aufgrund der Antikörper-basierenden Methode kann mit einem Antikörper nur ein Protein zur Zeit nachgewiesen werden

• Identifiziert Sequenzen der DNA, die in eine Pflanze eingebaut wurden

• DNA ist relativ stabil

• Real-Time PCR quantifiziert das GM-Material der Lebensmittelprobe

• PCR kann 85 % aller gentechnisch veränderter Kulturpflanzen detektieren (CaMV35S und T-NOS)

• eher schlecht in der BRD (ca. 80% Abneigung)

• “ohne Gentechnik” Siegel hat sich bewährt -> Hohe Anforderungen bezüglich Haltung, Reinheit und Kennzeichnung

• Vieh darf nicht mit GVO gefüttert werden

• Futtermittelzusätze, Arzneimittel, Impfstoffe durch GVO sind aber erlaubt

• DNA wird aus der Lebensmittelprobe isoliert

• mit spezifischen Primernnfür die gesuchte Sequenz wird eine PCR-Reaktion durchgeführt

• T-NOS und CaMV355 als häufig in der Gentechnik verwendeter Promotor bzw. Terminator werden nachgewiesen

• falls die gesuchte Sequenz nicht in der isolierten DNA vorhanden ist, können die Primer nicht binden und es findet keine DNA-Vervielfältigung statt

• zweite PCR mit dem Primer Photosystem-II-chloroplastgen (kommt in allen Pflanzen vor)

• die zwei PCRs führt man zusätzlich zur Lebensmittelprobe noch mit einer Positiv- und einer Negativkontrolle durch

• ein Lebensmittel, von dem man sicher sein kann, dass es nicht gentechnisch verändert wurde

• es darf kein für das transgene Material spezifisches PCR-Produkt nachgewiesen werden

• da die Negativprobe aber eine Pflanze ist, sollten die Primer für das Photosystem-II-chloroplastgen zu einem PCR-Produkt führen

• es handelt sich um in Wasser gelöste DNA, die sowohl die DNA-Sequenz für T-NOS und CaMV355 als auch das Photosystem-II-chloroplastgen enthält

• mit der Positivkontrolle sollte also mit all unseren Primern ein PCR-Produkt erhalten werden

• viertel bis halbe Tomate in kleine Stücke schneiden

• 15 ml Extraktionspuffer zugeben und für 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren

• Tomatenstücke im Puffer mit einem Pistill sehr fein zerdrücken

• mit Trichter und Filter in ein durchsichtiges Gefäß filtrieren

• Vorsichtig Ethanol auf der Oberfläche Schichten

• An der Grenzfläche mit einem Schaschlik-Spieß eine schleimige Flocke (isoliertes genetisches Material) anrühren

• Ethanol entzieht den DNA-Molekülen ihren Hydratmantel, weshalb sich diese nicht in Ethanol lösen können und als DNA-Fäden ausfallen

• durch den fehlenden Hydratmantel können die DNA-Fäde teilweise zwischenmolekulare Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden und sich verknäulen, weshalb sie eine große sichtbare schleimige Flock ausfallen

Primer werden immer in 5’-3’-Richtung aufgeschrieben!

Der revers Primer muss revers und komplementär zu den letzten 18 abgebildeten Basen aufgeschrieben werden

komplementären

abgebildeten

Lebensmittel ist GVO-positiv!

Lebensmittel ist GVO-negativ!

• Besonderheit: nicht nachweisbar

• sehr präzise Methode

• Enzym Cas9 aus Bakterien mit gebundener RNA, die Cas9 zu der DNA führt, an diese bindet und sie dann schneidet (zerstört)

• mittels der guide RNA bindet das Enzym Cas9 spezifisch an eine bestimmte Stelle des Genoms