03.12

Maldi—> single charge to every molecule

ESI—>multiple charges depending on size of the analyte

MALDI: jedes Molekül erhält eine einzelne Ladung

ESI: mehrfache Ladungen, abhängig von der Größe des Analyten

-translating mass to time detection

-sorting and detecting

-quantification

F=m*a

plotting the mass to charge ratio (m/z)

• Umwandlung von Masse in Zeitdetektion

• Sortierung und Detektion

• Quantifizierung

F = m × a

• Darstellung des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses (m/z)

-TOF (beam type analyzers), resolution increasing with M/Z

-Orbitrap (trapping analyzers), resolution decreasing with M/Z

• TOF (Time-of-Flight, Strahlanalysatoren): Auflösung steigt mit zunehmendem m/z

• Orbitrap (Trapping-Analysatoren): Auflösung sinkt mit zunehmendem m/z

The proteome is the entire set of proteins that an organism, tissue, cell type, or biological system expresses at a given time and under specific conditions

Proteomics is the large-scale study of proteins — their identities, abundances, structures, modifications, interactions, and functions

Das Proteom ist die gesamte Menge an Proteinen, die ein Organismus, Gewebe, Zelltyp oder biologisches System zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter spezifischen Bedingungen exprimiert.

Proteomik ist die groß angelegte Untersuchung von Proteinen – ihrer Identität, Menge, Struktur, Modifikationen, Interaktionen und Funktionen.

Top down proteomics (intact proteins)

Middle down Proteomics (medium length peptides)

Bottom up Proteomics (short peptides)

• Top-Down-Proteomik: Analyse von intakten Proteinen

• Middle-Down-Proteomik: Analyse von Peptiden mittlerer Länge

• Bottom-Up-Proteomik: Analyse von kurzen Peptiden

1. High complexity of the proteome (many isoforms and proteoforms)

2. Wide dynamic range of protein abundances

3. Difficulties detecting and analyzing post-translational modifications

4. Challenging sample preparation and incomplete digestion (losses during clean-up)

5. Instrumental and data analysis limitations in identifying and quantifying all peptides

• Hohe Komplexität des Proteoms (viele Isoformen und Proteoformen)

• Großer dynamischer Bereich der Proteinmengen

• Schwierigkeiten bei der Detektion und Analyse posttranslationaler Modifikationen

• Herausfordernde Probenvorbereitung und unvollständige Verdauung (Verluste während der Reinigung)

• Instrumentelle und datenanalytische Einschränkungen bei der Identifizierung und Quantifizierung aller Peptide

1) Sample preperation using in-gel or in-solution digestion

—>generating peptides from proteins

2) nano UPLC or electrophoresis separation

3)IMS/MS analysis

4)data aquisition and statistical evaluation

1. Probenvorbereitung mittels In-Gel- oder In-Solution-Digestion → Erzeugung von Peptiden aus Proteinen

2. Trennung durch nano-UPLC oder Elektrophorese

3. IMS/MS-Analyse

4. Datenerfassung und statistische Auswertung

—>using Tandem MS (MS/MS)

—>peptides fragment at predictable locations on the peptide backbone

Calculate mass differences between consecutive fragment peaks

—>each mass difference corresponds to the mass of a specific amino acid

—>Reconstruct the peptide sequence by reading the ordered fragment ions and matching the mass steps to amino acids

→ Verwendung von Tandem-MS (MS/MS)

→ Peptide fragmentieren an vorhersehbaren Stellen des Peptidrückgrats

• Berechnung der Massenunterschiede zwischen aufeinanderfolgenden Fragmentpeaks → Jeder Massenunterschied entspricht der Masse einer spezifischen Aminosäure

→ Rekonstruktion der Peptidsequenz, indem die geordneten Fragmentionen gelesen und die Massenschritte den Aminosäuren zugeordnet werden