SDS PAGE
a. Prinzip erklären unter Nennung der Funktion von SDS
b. Welchen Einfluss hat die Konzentration des Gels auf die Trennung?
a) Trennung von Proteinen nach ihrer Größe--> denaturierte Proteine in Polyacrylamidgel geladen--> elektrische Feld anlegen und Proteine wander zur positive Elektrode
SDS als anionisches Detergens, das Proteine denaturiert und ihnen eine gleichmäßige negative Ladung verleiht--> Eigenladung der Proteine wird überdeckt und nur noch molekülgröße ist wichtig
b) Je höher die Konzentration des Polyacrylamid Gels, desto kleiner die Poren--> bessere Trennung kleiner Moleküle
Je niedriger die Konzentration, desto größer die Poren--> geeignet für große Moleküle
Trennmethoden
a. Nenne 3 chromatographische Methoden zur Trennung von Proteinen und erläutere die jeweilige Trennung kurz (4,5 Pkt.)
Ionenaustauschchromatographie: Trennung nach Ladung (je nach Nettoladung binden Proteine an positiv oder negativ geladene Matrix)
Größenausschlusschromatographie: Trennung nach Molekülgröße (größe passieren Säule schnelle, kleine verzögert durch Poren)
Affinitätschromatographie: Trennung nach spezifischer Bindung (Zielprotein bindet selektiv an Liganden auf Matrix)
3 Aminosäuren (Asp, Ala, Arg) liegen bei pH7 vor. In welcher Reihenfolge eluieren die Aminosäuren in einem Kationenaustauscher? Erläutere die Antwort mittels Strukturformeln (6 Pkt.)
Kationenaustausche bindet positiv geladene Moleküle
Asparaginsäure bei pH7: negativ geladen und wird abgestoßen--> eluiert zuerst
Alanin bei pH7: neutral geladen und klein--> eluiert danach
Arginin bei pH7: positiv geladen--> bindet stark--> eluiert zuletzt
Bei einem Anionen-Austauscher werden Immunglobuline bei pH7 eluiert und Serumalbumin bei pH 4. Was sagt dies über die Proteine aus? (2 Pkt.)
Anionenaustauscher bestizt positiv geladene Gruppen und bindet daher negativ geladene Proteine
Immunglobuline eluieren bei pH7--> bei pH7 nicht stark negativ geladen oder neutral (nahe am isolelektrischen Punkt)--> binden nur schwach an Anionenaustauscher--> eluieren früher--> Immunglobuline haben isoelektrischen Punkt nach pH7
Serualbumin eluieren bei pH4--> bei pH7 stark negativ geladen und binden fest an Anionenaustauscher--> bei pH4 weniger negativ Ladung--> isoelektrische Punkt bei 4,7-5,0
a) Gelelektrophorese erklären, also was untersucht wird
b) 2 Parameter nennen, die die Wanderungsgeschwindigkeit beeinflussen.
c) Welcher DNA- interkalierender Fluoreszenz- Farbstoff kann bei einer Gelelektrophorese verwendet werden? Funktionsmechanismus erklären
a) analytisches Trennverfahren, Trennung von geladenen Biomolekülen wie DNA/RNA/Protein nach Ladung und Größe, Gel (Agarose/Polyacrylamid) als Molekularsieb, elektrische Feld angelgt damit negativ geladene Moleküle zu positiven Elektrode (Anode) wandern und anderherum
b) Molekülgröße (je kleiner, desto schneller, größere Moleküle bleiben in Poren hängen), Ladung des Moleküls (höhere Nettoladung schneller, pH Wert vom Protein)
c) Ethidiumbromid--> Interkalation: schiebt sich zwischen Basenpaare der DNA Doppelhelix--> veränderte Elektronkonfiguration--> Ethidiumbromid fluoresziert unter UV-Licht--> Intensität der Fluoreszenz proportional zur Menge an DNA
Coomassie Blue zur Färbung von Proteinen bei SDS Page
a) Semi Dry Verfahren erklären
b) wie werden geblottete Proteine durch Western und indirekte Immunfärbung detektiert?
a) Methode zur Übertragung von Proteinen auf eine Membran mit anschließender Detektion im Western Blot--> Gel und Membran zusammen mit mehreren Filterpapieren zwischen 2 Elektroden in Transferpuffer--> elektrisches Feld wird angelegt--> Protein von Geld auf Membran
b) Western Blot: Membran geblockt, um spezifische Bindungen zu verhindern--> spezifische Proteine mithilfe von Antikörpern
Marcus
Dixon Plot
Was ist das?
Wie löst man das auf?
Bestimmung der Inhibitionskonstante (Ki) bei kompetitiver oder nicht kompetitiver Hemmung eines Enzyms
Reaktionsgeschwindigkeit (v) bei verschiedenen Substratkonzentrationen und Inhibitorkonzentration
1/v bestimmen--> 1/v als y Achse und Inhibitorkonz als x Achse
für jede Substrakonzentration eine eigene Linie einzeichen
Schnittpunkt der Linien auf x-Achse ablesen--> Ki
VERSTEHE ICH NICHT GANZ
a) Von welchen natürlich vorkommenden Zellen stammen die Antikörper, die in den Versuchen des Praktikums (Western Blot, ELISA) verwendet wurden? Welche zwei Arten von Antikörpern bezogen auf die Antikörperherstellung gibt es? (1,5 Punkte)
b) Welche Rolle spielt das BSA-Protein im ELISA? (2 Punkte)
a) natürlich vorkommende B Lymphozyten, dann zu Plasmazellen
b) BSA (Bovine Serum Albumin): Blockierungsreagenz--> verhindert unspezifische Bindungen auf ELISA Platte, damit Antikörper nur an Zielprotein bindet, erhöht Signalgenauigkeit
a) Was ist ELISA
b) Was bedeutet Affinität
c) Was bedeutet Avidität
d) Was ist ein Epitop
e) Was ist ein Paratop
f) Was ist der Vorteil von sekundären Antikörpern
g) Ist ELISA qualitativ und quantitativ
a) Enzyme linked Immunosorbet Assay= Nachweis und zur Quantifizierung von Antigenen und Antikörpern mitilfe enzymmarkierter Anitkörper
b) Stärke der Bindung zwische Antikörper und einem einzelnen Epitop
c) gesamte Bindungsstärke eines mehrwertigen Antikörpers zu einem mehrwertigen Antigen
d) spezifische Stelle auf Antigen, die vom Antikörper erkannt wird
e) Bindungsstelle am Antikörper, die das Epitop erkennt
f) verstärken das Signal, da mehrere sekundärer Antikörper an einen primären binden können
g) ja, qualitativ für Nachweise und quantitativ für Signalintensität
Proteine
a) Je zwei Mittel zu Denaturierung und zur Reduktion von Proteinen nennen.
b) Warum werden Proteine zur Bioanalytik reduziert?c) Protein wird erhitzt, ändert sich die Sequenz oder die Struktur? Begründen Sie.
a) Denaturierungsmittel: Harnstoff, SDS (Natriumdodecylsulfat)
Reduktionsmittel (spalten Disulfidbrücken): DTT (DIthiothreitol), beta Mercaptoethanol
b) Disulfibrücken spalten--> Entfaltung--> alle Untereinheiten getrennt--> wichtig für Molekulargewichtsbestimmung (SDS Page)--> Zugänglichkeit von Epitope für Antikörper im Western Blot
c) Sequenz bleibt gleich--> Primärstruktur ist nicht temperaturabhängig (kovalente Peptidbindung hitzestabil)
Struktur ändert sich--> Sekundär-/Tertiär-/Quartärstruktur wird denaturiert (nicht kovalente Bindungen sind nicht hitzestabil)
Proteinsequenzierung
a) Sie führen eine Festphasensynthese durch, Synthese stoppt. C-Terminus ist noch am Harz, wie kann die Proteinsequenz bestimmt werden. Begründen Sie ihre Entscheidung.
b) Die drei Schritte der Edman-Sequenzierung nennen.
a) Edman Sequenzierung nicht geeignet, da sie vom N Terminus aus arbeitet und bei Festphasensynthese noch nicht freigelegt
Massenspektrometrie (MALDI-TOF)--> Peptidkette enzymatisch oder chemisch am Harz abgespalten--> Massen der Fragmente analysieren und daraus Sequenz rekonstruieren--> Vorteil: schnell, empfindlich, unabhängig vom freien N Terminus
b) Markierung, Abspaltung, Identifikation
a) UV Absorption bei 280 nm--> für genaue Konzentrationsbestimmung muss Extinktionskoeffizient des Proteins bekannt sein
b) beruht auf Lamber Beerschen Gesetz
Farbstoffbindung von Coomassie Brilliant Blue an Proteine
Absorption bei 595 nm
zustäzlich zur Porbe muss eine Standardreihe mit bekannten Proteinmengen vermessen werden--> Kalibrierung und Konzentrationsberechnung
c) Lowry Methode, BCA Assay, Kjeldahl Methode
Mit welchen Methoden kann folgendes bestimmt werden? (eine Methode pro Stichpunkt)ProteingehaltSequenzReinheit
Proteingehalt: Bradford Assay
Sequenz: Edman Sequenzierung
Reinheit: SDS PAGE
Markus: d
Ein Patient zeigt eine Allergiereaktion.
a) Auf welchen Antikörper würden Sie testen?
b) Die Antikörperkonzentration liegt bei 800 [Einheit], der Normalwert liegt bei 250 [Einheit]. Was sagt das aus/ welche Information können Sie daraus schließen?
c) Bei welcher ELISA wird die Detektion mit steigender Antigenkonzentration geringer?
d) Zeichnen Sie diese ELISA in 4 Teilschritten auf.
a) IgE: spezifische für allergische Reaktion aller Arten
b) deutlich erhöht--> Hinwei auf aktive allergische Reaktion oder Sensibilisierung gegenüber einem Allergen
c) kompetitiver ELISA: höhere Antigenkonzentration verdrängt das markierte Antigen--> weniger Signal
d)
Fixiertes Antigen auf ELISA Platte
Probe mit unbekannter Antigenmenge hier nicht AK? + markiertes Antigen wird zugegeben
Antikörper bindet entweder an das Plattenantigen oder das freie Antigen
Signalmessung: weniger Bindung an Platte= weniger Signal bei viel freiem Antigen
Marcus: wiederspruch der kompetetiven Elisa zur anderen Folie.
Welche Arten von ELISA gibt es? (4)
direkter ELISA: markierte Primärantikörper bindet direkt an Antigen (einfach, wenig sensitiv)
indirekter ELISA: unmarkiert Primärantikörper--> markiert Sekundärantikörper (Signalverstärkung)
Sandwich ELISA: Capture Antikörper fixiert Antigen, Detektionsnatikörper erkennt das gebundene Antigen (Sehr spezifisch und sensitiv)
kompetitiver ELISA: Probe Antigen konkurriert mit markiertem Antigen um Antikörper, mehr Antigen = mehr Signal, ideal für kleine Moleküle
a) Zeichnen Sie den ersten Zyklus der PCR.b) Warum ist nach dem ersten Zyklus nicht das gewünschte Produkt vorhanden?
Denaturierung (95°C)--> DNA Stränge trennen sich
Annealing (50-65°C)--> Primer bindgen an komplementäre Sequenzen
Elongation (72°C)--> DNA Polymerase verlängert die Stränge
b) neue Stränge enthalten noch überhängende Bereich--> exakte Zielsequenz entsteht erst ab Zyklus 3
Aufgabe 3: SDS
a) Erläutern Sie den Unterschied zwischen Trenn- und Sammelgel & welche Effekte haben diese?
b) beschreiben Sie wofür man Glycerin, SDS & Bromphenolblau benötigt?
Glycerin: erhöht Dichte--> Probe sinkt in Gel Tasche
SDS: denaturiert Proteine, verleiht negative Ladung
Bromphenolblau: Farbstoff zur Kontrolle der Laufgeschwindigkeit
Was für Proteine sind Hämoglobin und Myoglobin
sauerstoffbindende Proteine
(SDS-PAGE)
a) Welche Informationen liefert die SDS-PAGE für Proteine? (1 Punkt)
b) Die Probenvorbereitung ist zur Durchführung der SDS-PAGE essentiell. Wie werden die Proben behandelt? Erläutern Sie welche Einflüsse hierbei in welcher Art auf die Proteine wirken! (3 Punkte)
c) Wodurch kommt es zur Trennung der Proteine in der SDS-PAGE? (1,5 Punkte)
a) SDS-PAGE= Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis--> Trennung von Proteinen nach ihrer Molekülmasse (Je kleiner, desto schneller)
b) SDS: denaturiert Proteine und verleiht negative Ladung und Reduktionsmittel (DTT, beta Mercaptoethnaol) spalten Disulfidbrücken und Erhitzen unterstützt Denaturierung
c) durch elektrisches Feld im Polyacrylamidgel--> Proteine wandern abhängig ihrer Größe--> Porengröße des Gels wirkt als molekulares Sieb
Marcus bitte Peptide zeichenn lassen
Marcus: b)
Ist die isoelektrische Fokussierung eine chromatographische oder eine elektrophoretische Methode? Begründen Sie.
elektrophoretisch
IEF: Proteine werden im elektrischen Feld getrennt, pH Gradienten im Gel
jedes Protein wandert so lange, bis es den pH Wert erreicht, der seinem ioselektrischen Punkt entspricht--> am isoleketirschen Punkt hat das Protein keine Nettoladun--> Fokussierung
Trennung erfolgt auf Basis der Ladung durch Bewegung im elektrischen Feld
Erläutern Sie das Prinzip der Größenausschlusschromatographie bei Proteinanalytik
große Moleküle passen nicht in die Poren der stationären Phase und werden schneller durch die Säule transportiert
kleine Moleküle dringen tiefer in die Poren ein und werden langsamer eluieren
Ablauf: stationäre Phase aus porösen Polymerkügelchen (Slikagel), mobile Phase aus wässriger Lösung, Trennung
große Proteine werden ausgeschlossen und eluieren früh
kleine Proteine verweilen länger in den Poren und eluieren später
Nennen sie 4 chromatographische Methoden mit denen man Proteine analysieren kann.
Ionenaustauschchromatographie (IEC)
Größenausschlusschromatographie (SEC)
Affinitätschromatogrpahie (AC)
Umkehrphasenchromatogrpahie (RP-HPLC)
Nennen Sie 2 Methoden zur Sequenzierung von Proteinen.
Edman Abbau
Massenspektrometrie
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