Erbinformation

• Epigenetik beschäftigt sich mit den Mechanismen, durch die phänotypische Veränderungen von Zellen vererbt werden können, die nicht auf Veränderungen in der DNA Sequenz beruhen

• Beispiel: DNA Methylierung

• Präszision: Genauigkeit der Basenpaarung--> Fehlerquote gering

• Prozessivität: Anzahl der Nukleotide, die ohne Absetzen synthetisiert werden

• Helikase: trennt DNA Stränge

• Primase: Synthetisiert RNA Primer

• Ligase: verbindet Okazaki Fragmente

• Topoisomerae: entwindet DNA

• SSB Protein: stabilisieren Einzelstränge

• statt DNA Polymerase wird in PCR Taq Polymerase genutzt

• keine Primase--> DNA Primer synthetisch zugesetzt

• bei PCR nur Polymerase und keine weiteren Enzyme

• a) Enzym, das Aminosäuren mit ihrer passenden tRNA verknüpft--> Translation im Cytoplasma--> mindesten 20 verschiedene tRNA Synthetasen (eine pro Aminosäure)

• b) Esterbindung, zwischen Carboxygruppe der Aminosäure und 3'-OH Gruppe der tRNA--> am CCA Ende der tRNA

• c) 

• a) DNA Abschnitt vor dem Gen, an dem die RNA Polymerase bindet--> steuert den Start der Transkription

• b) 5' Capping durch Guanylyltransferase zum Schutz vor Abbau, Polyadenylierung am 3' Ende durch Poly(A)-Polymerase zum Export aus Zellkern, Spleißen durch Spliceosom zur Bildung reifer mRNA (nur bei eukaryoten)

• c) gezielte Veränderung der RNA Sequenz nach Transkription (Basenaustrausch)--> Vorteil: erhöht Proteinvielfalt

• d) Proteine, die die Transkription regulieren, binden an Promoter oder Enhance, aktivieren oder hemmen RNA Polymerase--> Beispiel: TBP (TATA-binding Protein)--> erkennt die TATA Box im Promotor und rekrutiert die RNA Polymerase II--> Start der Transkription (Teil des TF IID Komplexes)

a)

• lac Operon als Genregulationssystem in E. coli zur Lactoseverwertung--> Lactose wirkt als Induktor-->

  • bindet an Repressor, dieser ändert seine Konformation und löst sich vom Operator

  • RNA-Polymerase kann transkribieren

  • Gene für beta-Gaalctoside, Permease und Transacetylase werden transkribiert

    -> lacZ: codiert für ß-Galactosidase (spaltet Lactose in Glucose und Galactose).​

    -> lacY: codiert für Permease (transportiert Lactose in die Zelle).​

    -> lacA: codiert für Transacetylase (Nebenfunktion, Detoxifikation)

• --> Lactose vorhanden und Glucose fehlt, ERST DANN Aktivierung

  
  

Negative Regulation (Substratinduktion durch Lactose)

• Ohne Lactose:

  • lacI bildet einen aktiven Repressor, der an den Operator bindet.

  • RNA-Polymerase wird blockiert, die Strukturgene lacZYA werden kaum transkribiert → keine Enzyme für Lactoseabbau.

• Mit Lactose (bzw. Allolactose als Induktor):

  • Lactose wird in Allolactose umgewandelt, die an den Repressor bindet.

  • Repressor ändert seine Konformation, löst sich vom Operator.

  • RNA-Polymerase kann transkribieren → Expression von lacZ, lacY, lacA, Abbau von Lactose wird ermöglicht.

    
    

Das ist eine induzierbare Regulation: Das Substrat (Lactose) schaltet die dazugehörigen Gene an.​​

Positive Regulation (Katabolitrepression durch Glucose/cAMP)

Die Zelle bevorzugt Glucose als Energiequelle.

• Viel Glucose:

  • cAMP-Spiegel ist niedrig.​

  • cAMP–CRP-Komplex bildet sich kaum, bindet nicht an die DNA.

  • Promotor wird nur schlecht von der RNA-Polymerase erkannt → lac-Operon nur sehr schwach aktiv, selbst wenn Lactose vorhanden ist.

• Wenig Glucose:

  • cAMP-Spiegel steigt, cAMP bindet an CRP (CAP).

  • cAMP–CRP-Komplex bindet an die Aktivatorstelle nahe dem Promotor und erleichtert die Bindung der RNA-Polymerase.

  • In Kombination mit vorhandener Lactose (Repressor abgelöst) kommt es zu starker Expression des lac-Operons.

Das ist eine positive Regulation durch einen Aktivator und gleichzeitig Katabolitrepression (Repression durch bevorzugten Kataboliten Glucose).

b) 

c)

• IPTG (ISopropyl-beta-D-thiogalactopyrosid)--> strukturell ähnliche zu Lactose, bindet an Repressor--> wird nicht abgebaut und bleibt dauerhaft aktiv--> kontinuierliche Genexpression

• a) TBP (TATA binding Protein) als Teil von TF IID Komplex

• b) RNA Spleißen durch Splicosom--> beeinflusst Proteinvarianten

• c) miRNA (microRNA)--> hemmt Translation oder führt zum Abbau der mRNA

• Helikase: trennt DNA Doppelstränge durch Spaltung der Wasserstoffbrücken (nutzt ATP zur Bewegung entlang der DNA)

• DNA Ligase: verknüpft DNA Fragmente (Okazaki Fragmente) durch Ausbildung Phosphodiesterbindung (nutzt ATP zum Aktivieren der Enden der DNA)

• Topoisomerase II: entwindet überdrehten DNA Strang (verhindert Supercoiling)

• a) einzelträngige DNA durch Helikase, Primer durch Primase, Stabilisierung der Einzelstränge durch SSB Proteine (Single Strand Binding Proteins)

b)

• Topoisomerasen Typ 1 und 2 sind Enzyme, die Überwindungen (Supercoiling) in der DNA lösen, um Prozesse wie Replikation und Transkription zu ermöglichen.

  ->Topoisomerase I: schneidet einen Strang (ATP unabhängig)

  -> Topoisomerase II schneidet beide Stränge (ATP abhöngig)--> Verhindern Supercoiling und Verhndern verdrillung der DNA

c)

• Promotorsequenz in DNA als Startsignal für Transkription

• erkannt von TATA binding Protein (TBP) aus TF IID KOmplex

• rekrutiert RNA Polymerase II

• Bildung Präinitiationskomplex

• a) funktionelle Einheit aus mehreren Genen, die gemeinsam unter der Kontrolle eines gemeinsamen Promotors und Operators stehen.--> gemiensame Transkription (lac Operon enthält Gene für Lactoseabbau)

• b)

• 1. Zellaufschluss: EDTA und Tris destabilisieren Zellwand, DNasen gehemmt

• 2. Lyse: SDS und NaOH zerstören Membran, denaturieren DNA und Proteine

• 3. Neutralisation: Kaliumacetat renaturiert Plasmid DNA, genomische DNA fällt aus

• a) T7 RNA Polymerase (erzeugt RNA aus DNA Vorlage)

• b) Okazakig Fragmente am Lagging Strand--> RNase H/Exonuklease (entfernt RNA Primer)--> DNA Polymerase I (ersetzt Primer durch DNA)--> DNA Ligase (verbindert Fragmente durch Phosphodiesterbindung)

• c) PCR nutzt nur einen Strang als Vorlage pro Zyklus und synthetische Primer definieren Startpunkt--> kein Okazaki Fragmente--> DNA wird linear und vollständig synthetisier--> kein diskontinuierlicher Strang

• Protein DNA Wechelwirkung: TBP an TAT Box

• Protein RNA Wechselwirkung: Ribosom während Translation

• Protein Protein Wechselwirkung: RNA Polymerase II + Transkriptionsfaktoren (TF IIB)

• RNA DNA Wechselwirkung: Primerbindung bi Replikation--> RNA Primer auf DNA Strang

• Protei Ligand Wechselwirkung: Repressor bindet an Lactose/IPTG im lac Operon

• b) Co Immunoprecipitation (Co IP)--> alternativ Far Western Blot